几丁质酶在COPD中的研究进展

苏莹莹 何丹丹 任靖宜 吴晓梅

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease， COPD)是引起全球慢性呼吸系统健康问题的主要原因之一，是全球范围内发病率和死亡率较高的一种常见的慢性肺部疾病。气道炎症、阻塞和重塑以及肺实质的结构改变是COPD最重要的特征，这些过程产生的临床症状(如咳嗽咳痰、运动不耐受、呼吸困难)与不可逆的进行性气流受限直接相关，尤其是在疾病加重时[1]。因此，为了早期诊断、监测和优化COPD的医疗管理以及改善预后，人们对探索与COPD相关的个性化的和新颖的生物标志物产生了浓厚的兴趣。近年来，几丁质酶(chitinases)[2]和结构相关的几丁质酶样蛋白(chitinase-like proteins, CLPs)YKL-40[3]在COPD中被认为是有价值的生物标志物，在COPD的发生、发展中起着重要的作用。

几丁质(又称甲壳质或甲壳素，chitin)是地球上仅次于纤维素的第二大丰富的天然碳水化合物聚合物，是细菌及真菌的细胞壁、甲壳类动物的外骨骼、寄生线虫微丝蚴鞘以及许多昆虫的消化道内壁的结构成分。几丁质是几丁质合成酶的酶促产物，需要特定的酶即几丁质酶才能降解[4]。几丁质酶又称壳质酶，是一类相对分子质量为20000～90000的糖基化水解酶，在植物、细菌、真菌、放线菌、昆虫与包括人类在内的动物中广泛表达。这些酶在免疫和防御、营养获取、消化、致病性和节肢动物蜕皮等方面发挥作用。而CLPs是一类由于高度保守的假定酶位点突变而缺乏几丁质酶活性但保留几丁质结合活性的蛋白质，哺乳动物几丁质酶和CLPs同属于进化保守的18糖基水解酶家族(GH18)[5-6]。

越来越多的证据表明[7-9]，几丁质酶和YKL-40在炎症、组织损伤和修复反应中发挥重要作用，从而导致各种人类疾病的发病。本文主要综述近年来几丁质酶和YKL-40的最新研究进展，并探讨其与COPD的关系，总结其在COPD中发挥的作用。

几丁质酶和YKL-40的生物学特性和功能

一、几丁质酶

GH18家族几丁质酶的结构域和结构特征是高度保守的，由N末端的催化结构域和C末端的富含半胱氨酸(C)的碳水化合物或几丁质结合结构域通过富含脯氨酸(P)的铰链连接组成。哺乳动物有两种真正的几丁质酶：壳三糖苷酶(chitotriosidase，CHIT1)和酸性哺乳动物几丁质酶(acid mammal chitinase，AMCase)，两者均具有内切酶活性[4]。

CHIT1是人体肺和血液循环中最主要的几丁质酶，其活性主要来源于CHIT1，而AMCase在人体中的贡献微乎其微。CHIT1基因位于染色体1q32.1，由13个外显子组成，全长约20 kb，是编码445个氨基酸的蛋白质[10]。CHIT1在多种组织中表达，如肺、脾、肝、胸腺和泪腺[11]。在这些细胞中，CHIT1主要由免疫细胞例如活化的巨噬细胞、中性粒细胞和结构细胞(例如上皮细胞)分泌，具有水解和转糖基化的活性[12-13]。该酶最适pH约为5，在低pH时是无活性的。CHIT1和AMcase均是分子量约为50kD的分泌蛋白[4]。近年来，CHIT1被报道参与了肺纤维化、支气管哮喘、COPD和肺部感染的分子发病机制，为其在肺病理生理中的作用提供了新的线索[10]。但是，CHIT1在肺内活动的确切作用机制尚未完全阐明。

AMCase是在人类中发现的第二种能够降解几丁质底物的几丁质酶，被认为是CHIT1的一种补偿酶，其基因位于染色体1p13.2，由12个外显子组成。肺上皮细胞、巨噬细胞和嗜酸性粒细胞可表达AMCase。该酶在酸性pH条件下非常稳定，在pH为2时表现出最佳活性，AMCase的名称也源自该酶的这一特性。据报道，AMCase在胃肠道和肺部具有水解活性，这可能表明其在消化和/或免疫防御中扮演重要角色[1,4-5,11]。AMCase能抑制白细胞介素-13(interleukin-13，IL-13)通路激活和趋化因子诱导，减轻2型辅助性T细胞(type 2 T helper cells, Th2)炎症，由此改善一些炎性疾病的进程[14]。AMCase在人类呼吸系统中的作用还没有得到充分研究，一些作者认为这种酶在人类肺中可能是不活跃的，而是小鼠肺部主要的几丁质酶[1,5]。

二、YKL-40

YKL-40也被称为几丁质酶3样蛋白1 (Chitinase 3 like 1,CHI3L1)， 是一种最初在小鼠乳腺癌细胞中发现的相对分子质量为40000的CLPs，因为其肽链起始端包括酪氨酸(Y)、赖氨酸(K)和亮氨酸(L)所以命名为YKL-40，其编码基因位于染色体1q32.1的一个高度保守的区域，大小为7948个碱基对并由10个外显子组成，与几丁质具有高度亲和力，但是由于在几丁质酶3样蛋白催化域中，谷氨酸(E)突变为亮氨酸(L)而不具有酶活性，而酶活性在许多器官和系统的动态平衡中起着重要作用[15-16]。YKL-40的确切生物学作用尚未可知，但作为一种炎症糖蛋白，它被认为参与调节细胞的增殖、黏附、迁移和激活[2]。在不同的哺乳动物的器官和组织(例如人类，牛，小鼠和山羊)中发现了YKL-40的表达。该酶的表达受到多种细胞因子的调节，包括IL-13、IL-6、IL-1β和干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)，可由各种类型的细胞产生，包括巨噬细胞、中性粒细胞、单核细胞、气道上皮细胞、软骨细胞、滑膜细胞、血管平滑肌细胞、乳腺细胞和实体肿瘤细胞[17-18]。迄今为止，CHI3L1已经成为阻塞性肺疾病(哮喘和COPD)患者中最广泛评估的CLPs。

几丁质酶和YKL-40在COPD患者发病中的作用

已有研究证据表明，AMCase在哮喘病人中具有潜在作用[14]，而CHIT1在COPD中具有潜在价值，即CHIT1是COPD组织病理改变的潜在的和重要的驱动因素，中和几丁质酶水解活性或限制CHIT1的合成有望成为COPD治疗的新靶点[19]。CHIT1与肺部炎症和损伤(如COPD)发病机制之间的关系可能如下：环境中的有毒物质、香烟烟雾暴露和其他因素，例如干扰素IFN-γ、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、粒-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)以及Toll样受体(toll-like receptor，TLR)和核苷酸结合寡聚域-2(nucleotide binding oligomerization domain-2，NOD-2)的激活均可增强肺泡巨噬细胞和中性粒细胞中CHIT1的表达，增加CHIT1的产生，刺激CHIT1的释放[1]。而CHIT1对于肺部细胞的影响是异质性的，一方面，CHIT1可增加巨噬细胞释放IL-8、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)和单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)从而介导组织炎症和肺泡破坏[19]。另一方面，可增加成纤维细胞中转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)信号的活性(例如，通过诱导TGF-β受体表达，抑制其反馈抑制因子SMAD7，并与伴侣蛋白TGF-β受体相关蛋白1(TGFRAP1)和FOXO3相互作用)促进细胞外结缔组织(如胶原)的产生，细胞外基质蛋白(extracellular matrix，ECM)的积聚，进而导致肺泡破坏和组织重塑[13,20-21]。

YKL-40也表现出类似的肺部效应。最近的一项系统综述和荟萃分析[3]表明，CHI3L1可能参与了COPD的发病机制，包括支气管炎症和气道重塑，可作为COPD诊断和监测的有价值的生物标志物，同时也是一个潜在的治疗靶点。YKL-40相关的肺气肿破坏、组织炎症和重塑可能涉及的机制如下：外界环境中的有害物质和/或香烟烟雾暴露以及两者间接导致的IL-1、IL-13、IL-17A、IL-18和TNF-α等多种介质的增加均可介导巨噬细胞、上皮细胞和中性粒细胞表达和分泌YKL-40[1]。CHI3L1诱导促炎和促纤维化介质的产生，最终导致组织炎症、肺泡破坏和重塑。这一复杂的过程涉及了炎症和组织反应的不同途径、机制和多个阶段。包括：1)YKL-40促进树突状细胞的激活和积累导致Th2细胞因子IL-4、IL-5、IL-9和IL-13的产生增加从而造成组织炎症，其中IL-13可刺激TGF-β增加导致组织重塑[22]。2)YKL-40可以通过丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和核转录因子-κβ(nuclear factor-κβ，NK-κβ)途径，促进支气管上皮细胞过度表达IL-8，并促进支气管平滑肌细胞迁移、增殖，导致组织炎症和肺泡破坏[23]。3)YKL-40可刺激肺泡巨噬细胞增生，而肺泡巨噬细胞一方面可刺激支气管上皮细胞依赖于IL-8的产生从而促进组织炎症和肺泡破坏，另一方面可刺激TGF-β或MCP-1、巨噬细胞炎症蛋白-1α(macrophage inflammatory protein-1α，MIP-1α)和MMP-9的增生造成组织重塑[24]。4)YKL-40可诱导成纤维细胞通过细胞外调节蛋白激酶(ERK)和p38依赖性途径来刺激成纤维细胞中胶原的产生进而导致组织重塑[25]。而Matsuura等人在小鼠中的研究[26]发现，肺内生理水平的CHI3L1对于阻止过度的炎症反应或气肿性肺泡破坏起到有利作用。

有研究结果[2,19,25,27-29]表明，COPD吸烟患者的血清，诱导痰(induced sputum，IS)和支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中CHIT1和YKL-40水平以及支气管上皮和黏膜下层表达CHIT1阳性的细胞数目明显高于非COPD吸烟患者和从不吸烟的受试者。COPD患者血清和BALF中较高水平的CHIT1和YKL-40与肺功能快速减退、气流阻塞和弥散性肺功能损伤的程度以及加重发作的频率有关。其他研究结果[30-31]也强调了血清中高水平的YKL-40与COPD的严重程度呈正相关。Lai等人研究[25]发现COPD急性加重期患者血清YKL-40水平和C反应蛋白(CRP)水平升高，且血清YKL-40升高与CRP呈正相关，与一秒用力呼气容积(Forced expiratory volume in one second， FEV1)和动脉血氧分压(PaO2)呈负相关。这在一定程度上提示，血清YKL-40水平升高可能预示了COPD的诊断和进展。Shirai等研究[32]认为CHI3L1和血清骨膜素的联合评估可用于ACOS与哮喘、COPD的鉴别诊断。上述研究均表明CHIT1和YKL-40可以作为COPD诊断和病情监测的可用生物标记。

皮质类固醇对几丁质酶和YKL-40水平的影响

皮质类固醇对几丁质酶和YKL-40水平的影响似乎是一个重要而值得探讨的问题。这不仅仅是因为皮质类固醇通常用于治疗哮喘和COPD，还因为已经有数据报道了系统性皮质类固醇对不同疾病患者几丁质酶水平的影响。早在1999年，Johansen等人[33]就报道了强的松龙治疗降低了类风湿性关节炎患者的血清CHI3L1水平。BIOAIR研究[34]表明，在常规治疗基础上加入两周口服泼尼松治疗(0.5 mg/kg·d),不会导致哮喘患者血清YKL-40水平和CHIT1的活性改变，然而在COPD患者中应用相同的治疗方案时会造成血清CHIT1活性降低,但CHI3L1水平并未降低。Kunz等人的研究[35]证实了地塞米松能强烈抑制促炎症巨噬细胞释放YKL-40。Lai等人的研究[36]最近显示吸入性糖皮质激素(ICS)治疗8周后，血清YKL-40水平降低，血清YKL-40水平与患者症状改善所需激素的剂量呈正相关。然而，ICS长期(30个月)治疗对于COPD患者痰和血清中YKL-40水平无明显影响[35]。血清YKL-40水平无明显变化，可能是因为ICS治疗过程中循环中皮质类固醇水平较低所致。此外，有数据[37]显示，与未患有COPD的吸烟者相比，COPD患者肺巨噬细胞对于皮质类固醇的敏感性下降。因此，阐明YKL-40和其他几丁质酶基因的表达是否直接受到皮质类固醇控制，似乎是十分重要的。

总结与展望

综上所述，几丁质酶和YKL-40不仅在气道免疫病理(包括慢性炎症和组织重塑)中发挥作用，而且在COPD的临床过程中也同样发挥着作用，即气道阻塞的严重程度、恶化的速率和对类固醇治疗的反应。它们在炎症中是起到保护性作用还是致病性作用一直存在争议。由此，未来我们要着眼于研究几丁质酶和YKL-40作为治疗干预的潜在靶点在COPD发病机制中的作用以及作为表现疾病特异性特征的生物标志物的作用。对几丁质酶抑制剂的研究[1]表明，甲基黄嘌呤(茶碱、咖啡因和己酮可可碱)不仅是GH18家族真菌几丁质酶的竞争性抑制剂，而且对人类几丁质酶也有活性，因此了解几丁质酶和YKL-40的生物活性有助于促进针对几丁质酶的特异性治疗药物在COPD中的未来发展。