oprC蛋白多克隆抗体制备及其免疫效果研究

陈 曦， 安 娜， 张 彬， 吴泳桦， 邓 蔷， 胡 冬

(四川省绵阳市中心医院检验科， 四川 绵阳 621000)

鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii，A.baumannii)属革兰氏阴性菌，属危害健康的主要病原菌之一，具有获得性耐药和环境适应能力，在医院环境中广泛存在，粘附性较强，可粘附在医用器材和医护人员手上、且存活时间较长[1]。目前国际上A.baumannii的疫苗尚未成功，导致A.baumannii感染在社区和医院存在，且患者死亡率较高[2]。另外，A.baumannii基因组对大多数抗菌药均产生耐药性，且随着临床上使用抗生素的逐年增加，导致耐药性逐年增强[3]，因此找到新的治疗和预防策略从而对抗A.baumannii的感染已成为目前刻不容缓的工作。近几年来，学者们对A.baumannii疫苗研究做出了较多探索，在研究中发现了灭活全细胞、外膜复合物和外膜囊泡等多组分抗原，外膜蛋白、膜转运蛋白、生物膜相关蛋白、荚膜多糖和膜相关多糖等单抗原[4,5]。但这些抗原安全性却有待研究。本文以A.baumannii外膜受体oprC为研究对象，探讨其抗体制备过程和生物学活性，为A.baumannii疫苗的研究提供一定参考。

1 材料与方法

1.1实验动物与试剂:健康BALB/c小鼠购自北京Vital River实验动物技术有限公司，SPF级，生产许可证号：SCXK(京)2019-0103，使用许可证号：SCXK(京)2019-0006，体重(20±2)g。EcoRⅠ、HindⅢ酶购自Thermo Scientific；T4连接酶购自SinoBio；异丙基硫代-β-D-半乳糖苷购自苏州亚科科技有限公司；弗氏完全佐剂购自美国Sigma公司。

1.2实验方法

1.2.1抗原的制备:ATCC 17978培养基培养A.baumannii 16～18h，提取总DNA，以NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)上oprC的DNA为目的基因，设计上游加EcoRⅠ(5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3')、下游加HindⅢ(5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3')酶切位点的引物，扩增目的片段，反应程序为：95℃、5min，95℃、30s，55℃、30s，72℃、2min，35个循环；72℃、10min。T4连接酶连接目的片段到pET28a上，得重组质粒。重组质粒转E.coli BL21感受态细胞中，制备单克隆菌落，并经双酶切和测序验证。单菌落37℃培养过夜，LB培养液在光密度值0.6时添加异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导目的基因表达，SDS-PAGE鉴定重组蛋白表达情况，同时空载上所含(标签)蛋白作为对照，载体标签为N-His、N-Thrombin、N-T7、C-His。

1.2.2重组蛋白的纯化:GST柱亲和层析法纯化蛋白。重组质粒菌液置于ATCC 17978培养液中培养并扩培，密度合适时离心收集细菌，每升菌液用50mL PBS重悬，加1%TritonC-100、1%β-巯基乙醇、苯甲基磺酰氟，并超声裂解菌体，15000g离心10min取上清并添加GST-beads，轻摇1h吸附蛋白；2000g离心3min弃上清，加1mL GST Elution Buffer，轻摇10min，2000g离心3min收集上清，SDS-PAGE鉴定蛋白纯度，Bradford法鉴定蛋白浓度，将蛋白置于-20℃保存。

1.2.3多克隆抗体的制备:纯化好的融合蛋白作为抗原免疫小鼠，目的蛋白:弗氏完全佐剂=1∶1混匀后采用多线注射法皮下注射小鼠，一免为0.1mg蛋白/小鼠；一周后二免，目的蛋白:弗氏不完全佐剂=1∶1混匀后，0.1mg蛋白/小鼠皮下注射小鼠；三免、四免方法与二免相同且间隔时间相同。四免结束后4d眼部采血，采集的血液于37℃恒温箱中静置1h，4℃冰箱过夜，待血清析出后移置新的离心管中置于-20℃冰箱保存。阴性对照组同一时间点注射等体积PBS做对照处理，同时相同方法收集血清做阴性对照。

1.2.4抗体效价测定:酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法测定抗体效价。抗原0.5μg，抗原包被液将抗原稀释至100μL，加入96孔板中，4℃过夜；加入200μL PBST+5%脱脂奶粉，4℃封闭过夜，以1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400、1∶12800、1∶25600、1∶51200梯度稀释阴性、阳性血清，每孔加100μL，37℃孵育1h；PBST洗板3次，加入1∶3000稀释辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG，每孔100μL，37℃孵育1h；加底物邻苯二胺100μL，37℃孵育20min，2moL/L H2SO4终止反应，读取OD 490，P/N≥2.1为判定标准，确定抗体最终效价。

1.2.5重组蛋白对感染小鼠的存活率:腹腔注射4.2×108CFU/mL A.baumannii，对60只小鼠进行攻毒实验，小鼠表现为弓背、竖毛症状时，30只小鼠注射oprC蛋白多克隆抗体，另30只小鼠只进行攻毒实验，从第0天开始至第21天观察小鼠生存情况，统计21d生存率。

1.2.6感染后血清中荷菌量情况:另每组随机6只小鼠感染12h，眼球静脉取血50μL，无菌条件下涂板，平板置于37℃培养箱中培养过夜，计数细菌定值量。

1.2.7HE染色各组小鼠脏器情况:1.2.6小鼠取静脉血后，分别取小鼠肺、肝脏、脾脏、肾脏，4%多聚甲醛固定，待固定后，经脱水处理，二甲苯透明，经包埋后，切片机切片，厚度4μm，苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察脏器病理变化和炎症损失。

2 结 果

2.1目的片段扩增成功:NCBI中oprC全基因组为模板PCR扩增长度为2115bp，全基因组扩增大小为>2000bp，大体与oprC基因全长预期相符。见图1。

图1 PCR扩增oprC序列琼脂糖胶图片

2.2双酶切鉴定重组质粒大小为1500bp-3000bp:目的片段与pET28a质粒连接，pET28a空质粒5369bp，筛选oprC+pET28a重组质粒，质粒图谱见图2。重组质粒经过EcoRⅠ、HindⅢ双酶切验证连接情况。oprC+pET28a重组质粒经双酶切后琼脂糖胶上呈现两个片段，1500bp-3000bp间为oprC片段，5000bp附近为pET28a质粒片段。空质粒pET28a片段长度5000bp附近。大小与预期相符。见图3。

图2 质粒图谱

图3 酶切鉴定重组质粒琼脂糖胶图片

2.3原核表达鉴定重组蛋白大小为70kDa:pET28a蛋白大小为26kDa，oprC蛋白大小为70kDa。异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导目的基因表达为蛋白，在97.2kDa附近蛋白表达量升高推测为oprC+pET28a重组蛋白(独立组分)，20.1kDa与29.0kDa之间某一区域蛋白表达量升高，推测为pET28a标签蛋白表达。大小与预期相符。见图4。

图4 重组蛋白鉴定SDS-PAGE胶图片

2.4抗体效价为1∶12800，ELISA法检测结果显示，oprC抗血清效价为1∶12800。见图5。

图5 oprC抗血清效价检测示意图

2.5oprC蛋白多克隆抗体提高小鼠的存活率:攻毒实验后注射oprC蛋白多克隆抗体小鼠存活率为80%，只进行攻毒实验小鼠存活率为30%，两者存活率比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图6。

图6 攻毒实验后小鼠生存率情况

2.6oprC蛋白多克隆抗体降低感染后血液中荷菌量:感染12h后，单纯攻毒实验小鼠血液中荷菌量为(4.3×105/CFU)，攻毒实验+oprC多克隆抗体小鼠血液中荷菌量为(1.9×105/CFU)；攻毒实验+oprC多克隆抗体小鼠血液中荷菌量明显低于单纯攻毒实验小鼠(P<0.05)。

2.7oprC蛋白多克隆抗体减轻组织病理损伤:攻毒实验显示小鼠肺组织中肺泡壁充血明显、间质内血管明显扩张，腔内出现明显的炎症渗出及炎症细胞浸润明显；肝脏组织内变化不明显；脾脏中红髓变大、白髓变小，淋巴细胞数量减少、变得稀疏；肾脏组织中肾小球出现肥大、系膜增厚现象，肾小球基底膜增厚，组织纤维化、炎症细胞浸润明显。攻毒实验+oprC多克隆抗体中肝脏差异不明显外，其余各组织症状均有所缓解。见图7。

图7 两组肺、肝脏、脾脏、肾脏病理性损伤情况

3 讨 论

A.baumannii是一种新型的机会型医院病原菌，A.baumannii感染表现为医院和社区获得性肺炎、血流感染、心内膜炎、泌尿道感染、伤口感染、烧伤感染、皮肤和软组织感染以及脑膜炎等[6]，危害严重。为降低A.baumannii感染的疾病，噬菌体和抗生素制剂治疗A.baumannii，造成A.baumannii耐药，严重影响治疗效果[7]。改善A.baumannii耐药性，可能是缓解疾病方法之一。A.baumannii外膜蛋白是目前研究最深入的耐药蛋白之一，A.baumannii附着在支气管上皮细胞中，参与氧化应激和抗微生物作用，从而发挥其功能[8]。外膜蛋白的研究中心在2014年6月研究中发现6个阳性蛋白，包括外膜蛋白ompA、omp34kDa，外膜受体蛋白oprC、oprB，OXA-23和铁载体受体蛋白，这些外膜蛋白均存在于菌体表面，且与细菌毒力、耐药性、细菌生长关系密切，可作为防治A.baumannii的抗原疫苗和被动免疫疗法候选组分[8]。外膜蛋白ompA主要分布于菌体及其外膜囊泡中，可诱发宿主细胞氧化应激，并侵袭至线粒体和细胞核中，促进细胞凋亡坏死[9]；omp34kDa参与细胞粘附作用[10]。外膜蛋白的主动和被动免疫均可提高小鼠的存活率，抑制器官和外周血中的细菌负担，并降低血清炎性细胞因子和趋化因子的水平[11]。外膜受体蛋白oprB影响葡糖糖转运过程，DNJ-NAc可通过OprB进入细胞，DNJ-NA是一种与葡萄糖具有相似抗感染性蛋白[12]。OXA-23样家族是伊朗A.baumannii和医院不动杆菌对碳青霉烯耐药的主要原因[13]。铁载体受体蛋白在细菌铁离子摄取机制中发挥重要作用，是细菌的毒力因子和潜在的疫苗靶基因[14]。外膜受体蛋白由于磷脂双分子层对膜受体的动态构象、信号转导及蛋白间的相互作用均有调节作用，可影响膜结构和功能。

本研究以外膜受体蛋白oprC为研究对象，其结构和功能尚未发现相关报道。根据NCBI中oprC的DNA全基因序列设计引物，在A.baumannii中克隆出全长，NCBI预测全长为2115bp，凝胶电泳预测正确。与pET28a构建重组质粒，并诱导重组蛋白大小表达，重组蛋白并作为免疫原免疫小鼠，得到抗血清抗体，抗体效价为1∶12800；且oprC蛋白多克隆抗体对A.baumannii感染小鼠有一定保护作用。小鼠全身感染A.baumannii模型在12h发现荷菌量在oprC蛋白多克隆抗体中出现明显降低现象，且肺、脾脏、肾脏炎症病理损伤得到明显改善。早期4d过程中死亡率较高，且机体接种疫苗的免疫效果较差，抗A.baumannii的被动免疫可诱导小鼠产生较高的oprC抗体，介导体液免疫反应，从而治疗疾病。

综上所述，本研究成功构建并表达oprC重组蛋白，制备oprC蛋白多克隆抗体，并对oprC抗体的免疫保护效果做了初步探究，为A.baumannii基因工程重组疫苗奠定一定的基础。