解淀粉芽孢杆菌JK10的鉴定及其对蓝莓根癌病的防治效果

姚 博，何依璐＊，张晋豪，魏兰芳，崔兴国，姬广海*

（1.云南农业大学 省部共建云南生物资源保护与利用国家重点实验室，云南 昆明 650201；2.云南农业大学 农科基础实验教学中心，云南 昆明 650201；3.云南省曲靖佳沃现代农业有限公司，云南 曲靖 655000）

【研究意义】蓝莓（Vacciniumspp.）又名笃斯、甸果、越桔等，为杜鹃花科越橘属多年生低灌木。蓝莓作为一种新兴果树，近年在许多国家发展迅猛[1-2]。中国作为亚洲蓝莓的主要栽培国家，2020年栽培面积已经超过6 万hm2，全国规模化种植省、直辖市、自治区达到27 个[3-4]。云南地区由根癌土壤杆菌Agrobacterium tumefaciens引起[5]的蓝莓根癌病目前已经成为制约蓝莓产业发展的主要病害[6]，而目前防治根癌病最有效的方法仍然是生物防治[7]。【前人研究进展】2010年阿根廷科学家首次报道悬钩子土壤杆菌A.rubi和发根土壤杆菌A.rhizogenes能导致蓝莓冠瘿瘤[8]。2019年德国科学家报道了一种分离自杜鹃冠瘿瘤组织的根瘤菌Rhizobium tumorigenes也能引起蓝莓冠瘿瘤[9]。2011 年傅俊范等[6]首次报道了中国辽宁、吉林、山东及黑龙江省蓝莓园区内蓝莓根癌病原菌为根癌土壤杆菌A.tumefaciens。2021年张荣琴等[5]对云南滇中地区蓝莓根癌病原菌进行鉴定明确其为根癌土壤杆菌；目前蓝莓根癌病的防治主要采用农业防治和化学防治。农业防治包括调节土壤pH、选用健康苗木，剔除发病苗木、中耕施肥避免伤根、防治线虫等。化学防治主要包括使用链霉素、波尔多液进行土壤消毒，病株使用噻霉酮、乙蒜素、硫酸铜、农用链霉素等灌根[4-5,10-11]。20 世纪70 年代Kerr 首次报道了利用放射性土壤杆菌A.radiobacterK84 菌株防治桃树根癌[12]。随后，陆续有生物防治根癌病的报道。甲基营养型芽孢杆菌B.methylotrophicus39b、解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens32a通过产生脂肽类物质抑制根癌土壤杆菌的生长达到生防的目的[13-14]。其它用于防治根癌病的生防菌有利迪链霉菌[15]、产碱杆菌[16]等。但目前除K84 菌株外，其余菌株仅用于试验研究均未在田间规模化应用，国内也未见登记的防治根癌病新的生防制剂，具体的生防机制也不明确。【本研究切入点】目前国内外尚无蓝莓根癌病生物防治的报道，本研究前期通过大量的室内筛选，得到一株对蓝莓根癌土壤杆菌有良好拮抗效果的生防菌JK10。【拟解决的关键问题】明确一株对蓝莓根癌土壤杆菌有拮抗效果的生防菌的种类，评价其温室及田间防效，初步探索其可能存在的活性物质，为蓝莓根癌病的绿色防控提供安全有效的技术支撑和理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

蓝莓根癌土壤杆菌L-11（16S rDNA 登录号：MK910214.1）由蓝莓冠瘿瘤中分离得到[5]；JK10（16S rDNA 登录号：OL825023）为蓝莓健康根内生细菌中筛选得到的一株具有广谱抑菌活性的生防细菌。番茄（中蔬4号）、向日葵（绿宝美食葵）均为市场购买；试验于云南农业大学和云南省曲靖佳沃现代农业有限公司完成，田间试验蓝莓品种为“Jewelry”，5年生苗。

1.2 培养基

YEM培养基：参考魏兰芳等[17]；解淀粉芽孢杆菌优化发酵培养基：以刘京兰等[18]配方为基础对解淀粉芽孢培养基进行改良，改良后培养基命名为BA培养基（1 L），配方为工业蛋白胨11.25 g、酵母浸粉3.75 g、工业蔗糖5 g、马铃薯淀粉5 g、MgSO4·7H2O 1.5 g、NaCl 1 g，自来水定容至1 L，使用1 mol/L 的NaOH 溶液将pH调至7.0，分装后灭菌备用。

1.3 试验方法

1.3.1 JK10 形态学观察与生理生化检测 JK10 在LB 培养基上活化后，观察菌落的隆起形状、透明度、颜色、质地、边缘等，挑取少许单菌落经革兰氏染色后置于光学显微镜下观察。JK10生理生化测定，并参考《常见细菌系统鉴定手册》进行鉴定。

1.3.2 JK10基因组DNA 提取与16S rDNA、gyrB基因扩增 使用细菌总DNA 提取试剂盒提取JK10基因组DNA；参照姚锦爱等[19]的方法与引物序列，对16S rDNA、gyrB基因扩增，将PCR产物送至北京擎科生物科技有限公司测序。

1.3.3 JK10 分子鉴定 将16S rDNA、gyrB基因序列提交到NCBI 核酸数据库中，进行BLAST 分析，对比GenBank中现有细菌的16S rDNA、gyrB序列，挑选相似序列，利用MEGA-X进行系统发育分析，采用邻接法构建系统发育树，通过Bootstrap 分析评价结果稳定性，重复数为1 000，分析同源性关系较近的菌株[20-21]。

1.3.4 JK10对蓝莓根癌土壤杆菌的拮抗作用及抑制起瘤效果 挑取在LB 培养基上纯化后的JK10单菌落，接入到BA培养基中30 ℃、160 r/min摇瓶培养36 h备用。将YEM 平板上生长蓝莓根癌病原菌用无菌水稀释成OD600=0.3 左右的菌悬液[22]，吸取100µL 于新的YEM 平板涂布均匀。平板内均匀放置3 只牛津杯，处理中加100µL JK10菌液，无菌水作为对照。28 ℃培养箱中放置36 h后测量抑菌圈直径，以此评价JK10对蓝莓根癌土壤杆菌的拮抗效果。

L-11、JK10 纯化后分别挑取单菌落于LB、BA 培养基中，28 ℃、150 r/min 摇床内过夜培养，然后使用无菌水分别将其OD600值调整到1.0 备用；参考高之蕾等[16]的接种方法和陶铁男等[23]的分级标准，以向日葵与番茄作为高感培养植株[24]评价JK10 对蓝莓根癌土壤杆菌的抑制起瘤效果。每个处理或对照10 棵向日葵苗，3次重复，参考王红艳[25]方法将拮抗菌与病原菌按照1∶1混合后接种至出苗10 d的向日葵苗子叶处，距离子叶下方5 cm 处再接种1次。30 d后使用游标卡尺测量瘤状物直径和向日葵茎粗，统计病情指数，计算JK10的防治效果。

参考万其露[26]的接种方法和陶铁男等[23]的分级标准，取上述混合后的混合菌悬液接种于30 d苗龄的番茄苗茎基部与距离茎基部5 cm 的位置，每棵番茄接种2 处，每个处理或对照10 棵番茄苗，重复3 次。60 d后参考使用游标卡尺测量瘤状物直径和番茄茎粗，统计病情指数。

1.3.5 菌株JK10对蓝莓根癌病的田间防治效果 JK10纯化后挑取单菌落接种于BA 液体培养基中，1 L三角瓶装液量500 mL，30 ℃、160 r/min 摇床培养36 h（菌量为5×1010cfu/mL）后带到蓝莓基地内进行灌根。选取蓝莓基地内发病中等较轻且一致的区域进行试验，每个小区30棵蓝莓苗，每个处理或对照重复3个小区，每棵处理每次灌根稀释50倍菌液（菌量为1×109cfu/mL）2 L，清水作为对照。1月10日开始，连续灌根3 次，2 次灌根间隔30 d。4 月初调查座果率，5 月调查3 次百粒质量，7 月底调查植株根部新瘤发生率以及病情指数。

1.3.6 JK10活性物质初探 生防菌JK10聚酮类和脂肽类化合物合成相关基因的检测参照桑建伟等[27]设计的引物序列，使用beaS、bacA、dfnA、dhbA、bmyA、fenA、ituC、srfAA这8对聚酮类和脂肽类化合物合成相关基因特异引物，对内生细菌JK10的基因组DNA进行扩增，然后使用12 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4 数据分析

使用SPSS 20和Excel 2016软件处理分析数据，显著差异水平P＜0.05用小写字母表示。参考张荣琴等[5]的分级标准将蓝莓根癌病的发生程度分为4个等级（表1）。新瘤一般特征为乳白色且较小，较软；老瘤颜色为深褐色，表面坚硬且较大。

表1 蓝莓根癌病分级标准Tab.1 Grading standards for blueberry crown gall

2 结果与分析

2.1 JK10鉴定结果分析

纯化后的JK10 于NA 培养基，28 ℃恒温培养24 h 后的菌落及菌株显微镜下的形态见图1。由图1A可知，JK10菌落呈乳白色或淡黄色、不透明、菌落扁平有褶皱、无光泽、边缘齿状；图1B显示，JK10菌体近椭球形，单个、成对或链状排列，革兰氏染色为阳性，芽孢中生。

图1 JK10菌落形态（A）和显微观察（B）Fig.1 JK10 colony morphology（A）and microscopic observation（B）

生理生化特征如表2 所示，JK10 能利用淀粉、葡萄糖、麦芽糖、果糖等；卵磷脂降解、明胶水解、酪氨酸水解等反应为阳性。参考《常见细菌系统鉴定手册》可以发现JK10以下特征与芽孢杆菌特征吻合。

表2 菌株JK10生理生化指标Tab.2 Physiological and biochemical characteristics of JK10

16S rDNA 比对结果显示，JK10 与Bacillussp.HB12274（KU529689.1）同源性最高，为99.24%，与B.amyloliquefaciensGKT04（KY328743.1）次之，为99.23%。图2A JK10 的16S rDNA 系统发育树显示，JK10 与Bacillussp.HB12274、B.amyloliquefaciensGKT04 聚在同一分支内，说明生防菌JK10 与这两株芽孢杆菌的遗传关系最近，可确定JK10 为芽孢杆菌属菌株；挑选相似度97%以上的多个不同菌株gyrB基因序列进行分析，构建系统发育树。进化分析显示（图2B），JK10 与所有的解淀粉芽孢杆菌都聚在了一起，且与亲缘关系较近的贝莱斯芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌分开，说明通过gyrB基因可以将JK10 鉴定到种；结合形态学观察、生理生化测定、分子生物学鉴定结果，最终将JK10鉴定为解淀粉芽孢杆菌，命名为Bacillus amyloliquefaciensJK10。

图2 16S rDNA（A）与gyrB（B）基因系统发育树Fig.2 16S rDNA（A）and gyrB（B）gene phylogenetic tree

2.2 JK10对蓝莓根癌土壤杆菌的拮抗作用及抑制起瘤效果

拮抗试验结果（图3）显示，与对照相比JK10菌悬液对蓝莓根癌土壤杆菌有明显抑制效果，抑菌圈达到（22±1.2）mm，且边缘整齐，说明JK10 菌悬液对蓝莓根癌土壤杆菌拮抗效果明显；向日葵活体接种试验结果表明，与只接种L-11菌悬液的对照相比，混合接种JK10与L-11菌悬液处理的向日葵苗病情指数为5.0±0.66，而对照为87.5±4.47，相对防效为94.28%；番茄接种试验结果表明，同时接种JK10 菌液的处理病情指数为10.0±1.44，只接种病原菌L-11 的对照病情指数为77.5±5.56，防效为87.09%；温室活体接种试验证明：菌株JK10 能有效抑制L-11 引起的向日葵、番茄冠瘿瘤，显著降低其病情指数，可用于下一步田间试验。

图3 JK10对蓝莓根癌土壤杆菌的拮抗作用以及抑制起瘤效果Fig.3 The antagonistic effect of JK10 on blueberry Agrobacterium tumefaciens and its tumor-inhibiting effect

2.3 JK10对蓝莓根癌病的田间防治效果

与对照和乙蒜素相比，蓝莓根癌病病区植株使用JK10菌液连续灌根3次后，显著增加了蓝莓植株的座果率和百粒质量，显著降低了蓝莓苗新瘤的出现率和病情指数（表3）。连续灌根3次即有明显的田间防治效果和增产作用，可用于蓝莓根癌病的田间防治。

表3 JK10对蓝莓根癌病的大田防效及产量的影响Tab.3 The effect of JK10 on blueberry crown gall prevention and yield in the field

2.4 内生细菌JK10脂肽类和聚酮类化合物合成相关基因的检测

由图4 可知，以内生细菌JK10 基因组DNA 为模板，可以扩增到BacillomycinD、Fengycin、Iturin、Surfactin、Bacilysin、Bacillaene、Difficidin、Bacillibactin 对应的合成基因，表明菌株JK10基因组DNA 中含有上述8 种脂肽类和聚酮类化合物合成基因。说明JK10 发酵液中可能含有相关物质，这些物质可能与其生防效果有关。

图4 脂肽类与聚酮类合成基因PCR检测Fig.4 The PCR detection of lipopeptide and polyketide compounds synthesis gene

3 讨论与结论

本研究使用的16S rDNA 与gyrB基因联合鉴定的方法，近年来常被用于未知菌株的快速鉴定。傅奇等[28]使用16S 与gyrB基因联合建树快速准确鉴定了一株解淀粉芽孢杆菌。卢佳琦等[29]结合生理生化和16S rDNA 与gyrB基因鉴定了一株蜡样芽胞杆菌。16S rDNA 基因序列普遍应用于细菌鉴别或构造细菌系统发育进化树，以弥补传统细菌鉴定的局限性，但是由于16S rDNA 序列间过高的相似度，此方法难以区别亲缘关系接近的菌种[30]。近年研究发现gyrA基因gyrB基因可弥补16S rDNA 基因法的缺点而被普遍使用，16S rDNA 和gyrB基因序列联合鉴定法是一种科学且被国际上认可的一种识别新分离物种身份的方法[31]。

筛选拮抗细菌是根癌病生物防治的一个思路[32]，李昱佳等[7]筛选得到的桃内生菌泛菌Pantoea deleyi与肠杆菌Enterobacter cowanii，均能有效抑制根癌土壤杆菌引起的向日葵冠瘿瘤。高之蕾等[16]筛选得到的粪产碱菌Alcaligenes faecalis对根癌土壤杆菌有良好拮抗作用，且强烈抑制根癌向日葵、番茄起瘤。张锡唐等[33]筛选得到的瓦雷兹芽孢杆菌Bacillus velezensis菌株对樱花根癌病防效达到了50%；本研究使用JK10发酵液连续对蓝莓根癌病植株连续灌根3次后，蓝莓根癌病植株新瘤发生率和病情指数较清水和乙蒜素对照都有显著降低，且防效达到56%，并且对蓝莓植株的坐果率和百粒质量也有一定的提高。这与张荣琴等[5]的研究结果防效45%相比，提高了11个百分点，这可能由于JK10来自健康蓝莓根组织内生菌，相较于其他生防菌更容易定殖。脂肽类与聚酮类化合物是解淀粉芽孢杆菌产生的常见抑菌物质。解淀粉芽孢杆菌32a 和甲基营养型芽孢杆菌39b 除能产生芽孢杆菌霉素外，还产生脂肽类混合物，且对根癌土壤杆菌引起的番茄冠瘿瘤防治效果良好[14,34]。Chakraborty 等[35]报道的解淀粉芽孢杆菌可产生多种聚酮类物质，对副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus、创伤弧菌V.parahaemolyticus有良好的抑制效果。Chen 等[36]报道的贝莱斯芽孢杆菌B.velezensisCLA178 产生的大环内脂类抗生素macrolactin 对根癌土壤杆菌C58 有较好的抑制活性。本研究通过对菌株JK10基因组中相关基因的扩增，证明其代谢物中可能存在多种脂肽类和聚酮类物质，具体哪种是主要抑制蓝莓根癌土壤杆菌的物质还有待研究。

本研究结合形态观察、生理生化测定和分子鉴定明确一株生防菌JK10为解淀粉芽孢杆菌。室内拮抗试验和温室活体接种试验证明菌株JK10 对蓝莓根癌土壤杆菌L-11 有良好拮抗作用和抑制起瘤的效果。田间防效试验证明，JK10 发酵液对蓝莓根癌病的田间防治效果良好，相对防效为56.4%，且有一定的增产作用，可以用作生防菌剂的开发和蓝莓根癌病的田间防治。

致谢：云南省“万人计划”产业技术领军人才（YNWR-CYJS-2019-046）同时对本研究给予的资助，谨致谢意！