香榧扦插生根解剖学与生理相关酶活性

金侯定，郑春颖，华 斌，俞晨良，李柯豫，喻卫武，*

(1.浙江农林大学 省部共建亚热带森林培育国家重点实验室，浙江 杭州 311300； 2.上海建设管理职业技术学院 园林技术与艺术学院， 上海 200232； 3.安吉县灵峰寺林场，浙江 安吉 313300； 4.杭州市富阳区农林资源保护中心，浙江 杭州 311400)

香榧(‘Merrillii’)为红豆杉科(Taxaceae)榧属(Arn.)榧树(Fort. ex Lindl)中的一个栽培类型，是我国特有的珍稀干果，资源稀少，生命周期长，集果用、油用、药用、材用、绿化观赏、生态等多种用途于一体。香榧生长缓慢，幼龄期非常漫长，无性繁殖可缩短培育周期。香榧的无性繁殖技术主要有植物组织培养、嫁接、扦插等。扦插繁殖可以保持林木优良品种固有性状，缩短育种周期，提高选择效率，具有生长均匀、生产力高、管理简便等优点；但扦插苗的缺点是植株生长势比较弱，容易早衰，一些林木受遗传或年龄成熟等因素限制，扦插困难。因此，有必要对香榧扦插技术和扦插苗生长生理做进一步研究。

1 材料与方法

1.1 香榧扦插生根过程的解剖学观察

在浙江省新昌市香榧苗圃基地采集10～12年生雌株树冠的中部硬枝，选择生长健壮、无病虫害和机械损伤、完全木质化的枝条。用2.5 mg·L标典3721扦插专用生根液(郑州标典科技开发有限公司)速蘸插穗基部30 s，然后进行扦插，共扦插250根。自扦插当日起到插穗大部分生根为止，每隔7～10 d取样1次。每次随机抽取5根插穗，用去离子水洗净并擦干，先进行外部形态观察，再取茎段基部(生根区域)3 cm左右，置于甲醛-乙酸-乙醇固定液(FAA)固定液(70%乙醇)中固定48 h后，倒出固定液，置于丙三醇、无水乙醇各半的软化剂中30～60 d备用。常规石蜡切片法制片，切片厚12～14 μm，番红-固绿染色后，用OlympusBX60正置荧光显微镜观察、拍照。

1.2 香榧扦插处理与取样

在浙江省新昌市香榧苗圃基地采集香榧硬枝进行扦插。插穗选择长15 cm、直径0.4～0.5 cm的枝条，并用锋利的刀片斜切，保持切口光滑平整。整个插穗浸泡在0.125%多菌灵(25%有效含量)溶液中消毒约2 min，沥干后放在阴凉处备用。分别用5 mg·L的标典3721扦插专用生根液速蘸插穗15 s、300 mg·L的生根粉GGR6(中国林业科学研究院提供)浸泡插穗20 min，以清水浸泡20 min作为对照；每处理300株，共900株。插穗的处理在采集后2 h内完成，去除基部总叶片1/3的叶片，处理过程中及时用湿毛巾包好插穗，以防止插穗失水、氧化。扦插深度为插穗总长度的1/3(5 cm)，插穗间距4 cm ×5 cm，压紧实插穗周围的基质，保证插穗基部与基质充分接触。于扦插前取样1次，扦插后每隔7～10 d取样1次，直至插穗生根，共取样14次，每次取12株，用冰盒带回实验室，清洗插穗并擦干，-80 ℃保存备用。每次各处理取4株用于酶活性测定，重复3次。

统计每个处理插穗的生根数、愈伤数、死亡数，每个处理统计30株，重复3次，一个处理共90株。生根统计时间(约扦插后65 d)：在大部分处理生根，主根伸长并且出现侧根时进行生根统计。愈伤数是指插条扦插后仅形成愈伤组织而未形成根的情况。生根数、愈伤数、死亡数三者的百分率之和为100%。

1.3 酶活性测定

1.3.1 POD活性测定

酶提取液的制备：取香榧插穗基部约3 cm皮层并剪碎，精确称取0.2 g放入预冷过的研钵中，加2 mL预冷的磷酸缓冲液(PBS，0.05 mol·L，pH值7.8)，加石英砂冰浴快速研磨成匀浆，倒入10 mL离心管内，再加2 mL PBS，分2次润洗研钵，使终体积为6 mL。4 ℃、10 000×离心20 min，所得上清液即为酶提取液。将上清液转移到10 mL离心管内，4 ℃保存备用，每处理重复3次。

采用愈创木酚比色法测定POD活性：在比色皿中加入3 mL POD反应液(100 mL 0.1 mol·LpH值6.0磷酸缓冲液+100 mL蒸馏水+100 μL愈创木酚+100 μL 30% HO)，再加入10 μL酶液；对照用蒸馏水代替酶液，其余成分相同；立即用紫外分光光度计(岛津UV-2600)读取470 nm的吸光度，每隔30 s读1次，读取反应3 min内的吸光度，以每分钟内Δ470变化0.01为1个酶活性单位(U)。

1.3.2 IAAO活性测定

酶提取液的制备：取香榧插穗基部约3 cm皮层，剪碎，精确称取0.5 g放入预冷过的研钵中，加2 mL预冷PBS (0.2 mol·L，pH值6.0)，冰浴快速研磨成匀浆，倒入10 mL离心管内，再加PBS润洗研钵，按鲜重100 mg材料加1 mL提取液的比例定容至5 mL。在4 ℃ 11 100×离心20 min，所得上清液即为酶提取液。将上清液转移到10 mL离心管内，0～4 ℃保存备用。取1.5 mL酶提取液于试管，加入1 mL MnCl、1 mL 2，4-二氯酚、2 mL IAA、1.5 mL酶液和4.5 mL磷酸缓冲液，均匀混合后置30 ℃水浴30 min。对照管用磷酸缓冲液替代酶提取液，其余成分相同。取水浴后试管溶液2 mL与4 mL反应液(10 mL 0.5 mol·LFeCl，500 mL 35%过氯酸，避光)小心混匀后，放在黑暗条件下的40 ℃保温箱，30 min后测定530 nm处的吸光度。IAA标准曲线的制作与上述方法相同，设置 0、0.5、1.0、2.5、5、10、15、20、25 μg·mL梯度浓度的IAA标准液替代1.5mL酶提取液。以IAA浓度(μg·mL)做为横坐标，对应值为纵坐标，绘制标准曲线。以1 mL酶液在1 h内分解破坏的IAA量(μg)表示酶活性大小。

1.3.3 PPO活性测定

酶液制备同1.3.2节IAAO活性测定，参照焦儿茶酚比色法测定。在3 mL PBS(0.05 mol·L，pH值6.0)中加入0.1 mL酶液混匀，在30 ℃恒温水浴锅中准确反应1 min，加入0.1 mol·L邻苯二酚溶液1 mL，测定525 nm处的吸光度，每隔30 s读取1次，读取反应最初5 min内的吸光度，以每min Δ525变化0.01为1个酶活性单位(U)。

1.3.4 SOD活性测定

酶液制备同1.3.1节POD活性测定。使用基于黄嘌呤氧化酶法的T-SOD试剂盒(A001-1， 南京建成生物工程研究所)测定。以1 g样品在1 mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位(U)。

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1.4 可溶性蛋白含量测定

取上述测酶活性的样品测定可溶性蛋白含量，提取液制备同1.3.1节POD活性测定。可溶性蛋白含量采用考马斯亮兰G-250染色法测定。取0.1 mL提取液，加入0.9 mL蒸馏水，放入带塞刻度试管中，加入5 mL考马斯亮兰G-250试剂，充分混合；放置2 min后在595 nm下比色，记录吸光度值。使用100 μg·mL牛血清蛋白作为标准溶液，配置0、20、40、60、80、100 μg·mL系列浓度，测定595 nm吸光度，绘制标准曲线。通过标准曲线查得可溶性蛋白含量。

1.5 数据与处理

利用Excel 2003软件对所测数据进行整理，用SPSS18.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 香榧插穗茎的解剖学观察

香榧枝条茎的初生结构是由表皮、皮层、维管柱3部分组成(图1)。表皮由一层排列紧密的细胞组成(图1-a和1-b)。皮层由多层薄壁细胞组成，细胞多为不规则的卵石状，皮层中分布着树脂道(图1-a)；树脂道为植物分泌组织之一，香榧枝条皮层中的树脂道由分泌树脂的上皮细胞和2～3层鞘细胞围绕而成。维管柱位于皮层内，由韧皮部、木质部、髓组成(图1-a)。韧皮部由筛胞、韧皮薄壁细胞组成，韧皮部靠近形成层区有含晶韧皮纤维，在横切面上呈长方形，细胞壁加厚(图1-c)。形成层由5～7层体积较小、排列紧密的细胞组成(图1-c)。木质部由管胞组成，髓由较大的薄壁细胞组成，有时能观察到叶迹或枝迹(图1-d)。在香榧茎的横切面观察中，未发现潜在的根原基。

a，茎横切；b，韧皮部与形成层；c，茎表皮；d，叶迹或枝迹。Cl，表皮层；Co，皮层；Ph，韧皮部；Php，韧皮薄壁组织；Rd，树脂道；CrF，含晶韧皮纤维；C，形成层；Xy，木质部；Pi，髓；LT/BT，叶迹或枝迹；Pi，髓；Vc，维管柱。a， Transectional shoot; b， Phloem and callus; c， Cuticle of the shoot; d， Leaf trace or branch shoot. Cl， Cuticular layer; Co， Cortex; Ph， Phloem; Php， Parenchyma in phloem; Rd， Resin duct; CrF， Crystalliferous phloem fiber; C， Cambial layer; Xy， Xylem; Pi， Pith; LT/BT， Leaf trace or branch trace; Vc， Vascular column.图1 香榧插穗的解剖学观察Fig.1 Anatomical observation of Torreya grandis ‘Merrillii’ cuttings

2.2 香榧插穗不定根形成的形态学变化过程

香榧夏季硬枝扦插繁殖的不定根均来源于愈伤组织。扦插后15 d在插穗基部切口位置出现少量愈伤组织；扦插后20 d愈伤组织明显隆起，颜色为黄褐色；扦插后35 d愈伤组织覆盖整个切口，颜色变深；扦插后45 d插穗切口底端出现黄色凸起；扦插后55 d部分插穗白色不定根突破愈伤组织表面；扦插后65 d不定根伸长，约半数插穗生根；扦插后95 d部分插穗出现一级侧根，不定根长约5 cm；扦插后170 d，一级侧根发达(图2)。

a，无愈伤组织(7 d)；b，出现薄薄一层愈伤组织(15 d)；c，愈伤组织明显隆起，颜色为黄褐色(20 d)；d，基部愈伤组织继续膨大(35 d)；e，基部底端出现黄色突起(45 d)；f，白色不定根突破愈伤组织表面(55 d)；g，不定根伸长(65 d)；h，出现一级侧根(95 d)。图中标尺均表示0.5 cm。a， No callus observed (7 days after cutting); b， A thin layer of callus observed (15 days after cutting); c， Obviously protruded yellow-brown callus (20 days after cutting); d， Continuously swelling callus (35 days after cutting); e， The yellow swelling observed at the bottom of the cut (45 days after cutting); f， White adventitious roots breaking through the callus surface (55 days after cutting); g， Elongating adventitious roots observed on half of the cuttings (65 days after cutting); h， The first grade lateral roots observed (95 days after cutting). Bar scale=0.5 cm.图2 香榧插穗不定根形成的外部形态变化过程Fig.2 Morphological changes in adventitious roots of Torreya grandis ‘Merrillii’ cuttings

2.3 香榧插穗不定根形成的解剖学观察

香榧扦插后，插条基部切口处能产生愈伤组织，创口处的皮层、韧皮部、形成层、髓等部位的薄壁细胞不断增生而形成愈伤组织，其细胞形状不一，排列紧密(图3-a、3-b)。随着细胞的不断分裂，愈伤组织数量不断增加，逐渐覆盖整个切口，插条基部膨大。随后愈伤组织中逐渐形成一团体积小、排列紧密、分生能力强的细胞，即根原基(图3-c)。随着根原基的不断发育，不定根和插条的维管组织互相连接形成维管系统，同时不断伸长，最终从插条基部的愈伤组织伸出而生根(图3-d)。

香榧扦插苗的不定根初生构造横向由表皮、皮层、中柱3部分组成；表皮的细胞排列紧密，部分细胞外壁向外突出形成根毛；皮层由多层细胞组成，能看到凯氏点；中柱由中柱鞘、辐射维管束组成(3-e)。纵向由根冠、分生区与伸长区组成(图3-f)。

a、b，愈伤组织形成部位；c，根原基；d，不定根与茎维管束连接；e，不定根横切；f，不定根纵切。Ca，愈伤组织；RPIC，根原基原始细胞；Cl，表皮层；Co，皮层；C，形成层；Xy，木质部；Pi，髓；Vc，维管柱；Ar，不定根；Per，中柱鞘；PX，初生木质部；PPh，初生韧皮部；RH，根毛；AM，顶端分生组织；M，分生区；Ez，伸长区；Ph，韧皮部。a and b， Formation of callus; c， Root primordia; d， Connection between adventitious roots and vascular bundle; e and f， Transverse and longitudinal sections of adventitious roots. Ca， Callus; RPIC， Initial cells in root primordia; Cl， Cuticular layer; Co， Cortex; C， Cambial layer; Xy， Xylem; Pi， Pith; Vc， Vascular column; Ar， Adventitious root; Per， Pericycle; PX， Primary xylem; PPh， Primary phloem; RH， Root hair; AM， Apical meristem; M， Meristem; Ez， Elongation zone; Ph, Phloem.图3 香榧扦插不定根发育的解剖学观察Fig.3 Anatomical observation of developing adventitious roots of Torreya grandis‘Merrillii’ cuttings

2.4 插穗扦插生根过程中相关酶活性与生根的关系

根据形态学观察，香榧在扦插生根过程中，0～35 d为根诱导阶段，35～105 d为始发阶段，105～135 d为伸长阶段。扦插后第197 d进行生根数、愈伤数和死亡数等指标统计，结果(表1)显示，5 mg·L标典3721扦插专用生根液处理插穗愈伤数最高，死亡数最少；各处理的生根数相近。

表1 不同处理对香榧扦插生根的影响Table 1 Effects of different treatments on cutting rooting of Torreya grandis

香榧插穗基部皮层的PPO活性总体呈上升-下降的单峰趋势(图4-b)。扦插后0～14 d先下降，14～35 d呈上升趋势，在第35天达到峰值，之后下降，第45天之后变化较小。标典、GGR6处理与对照组总体趋势一致，在第35天达到峰值时，对照组PPO活性高于GGR6，而标典处理的PPO活性低于GGR6处理。在第105天后，标典处理和对照组PPO活性呈缓慢上升趋势，而GGR6处理呈先上升后下降趋势。

香榧插穗基部皮层的IAAO活性总体呈下降-上升趋势(图4-c)。外源生长调节剂处理插穗IAAO活性高于对照。扦插后0～35 d，香榧插穗各处理IAAO活性急剧下降；标典处理在扦插后35～85 d呈缓慢上升趋势，在第85天达到峰值后活性下降，直到第105天后上升；GGR6处理的IAAO活性在第55天达到峰值后缓慢下降，直到第105天活性达到较低值后再上升；对照组在扦插后28～65 d IAAO活性一直较低，第75天达到较小峰值后下降，第95天达到最低值，之后活性上升。

香榧扦插生根过程中，插穗基部皮层SOD活性总体呈下降-上升趋势，对照组与外源生长调节剂处理的SOD活性上升时间不同。对照组SOD活性在扦插后0～14 d上升，14～28 d呈下降趋势，28～45 d急剧上升，之后活性恢复到扦插前水平。GGR6处理SOD活性在扦插后0～14 d上升，14～35 d呈下降趋势，第35天后上升，之后稳定在扦插前水平。标典处理的SOD活性在扦插后0～14 d下降，14～21 d上升，21～45 d下降，在第45天急剧上升，之后也稳定在扦插前水平(图4-d)。

数据以鲜重计。下同。Data was detected based on fresh weight. The same as below.图4 香榧插穗生根过程中相关酶活性的变化Fig.4 Changes of related enzyme activities during rooting of Torreya grandis cuttings

2.5 香榧扦插生根过程中可溶性蛋白含量变化

香榧扦插生根过程中，各处理插穗基部皮层可溶性蛋白含量变化有3个峰值(图5)。3种处理在扦插后0～21 d可溶性蛋白含量都上升。标典处理在21～35 d下降到最低值，35～75 d不断上升，第75天后开始下降，至第85天可溶性蛋白含量下降至最低后呈上升趋势，第105 d下降。GGR6处理在28 d后下降到最低值，35～45 d含量上升，55～65 d又下降，85～125 d呈上升趋势。标典处理的可溶性蛋白含量峰值高于GGR6处理和对照。

图5 香榧插穗生根过程中可溶性蛋白含量变化Fig.5 Changes of soluble protein contents during rooting of Torreya grandis cuttings

3 结论与讨论

香榧多嫁接繁殖，仅砧木至少要培养2 a，常用2+2(2年生的砧木嫁接2年生的接穗)的苗木，生产周期很长，而扦插繁殖在生产上尚未广泛应用。从插穗的解剖结构来看，如果存在环状厚壁组织且连续排列，则扦插生根较困难。珙桐()扦插成活率低，与茎中无潜伏根原基和存在环状厚壁组织有关。板栗()的茎解剖发现，靠近初生韧皮部的皮层中有数层厚壁纤维细胞，并连成环状，影响不定根形成。Hu等对2～100年生香榧的茎解剖时发现，香榧茎次生韧皮部的轴向系统由筛胞、含晶韧皮纤维、韧皮薄壁细胞和石细胞组成，含晶韧皮纤维为连续或间断切向带，石细胞星散分布在韧皮薄壁组织细胞带中，含晶韧皮纤维长度和香榧枝条年龄成正比。李伊乐研究表明，香榧次生韧皮部有含晶韧皮纤维，呈近似弦向排列。含晶韧皮纤维是一种特殊的厚壁组织，松科(Pinaceae)、红豆杉科(Taxaceae)植物的茎中均有发现，香榧含晶韧皮纤维细胞壁上嵌埋着草酸钙结晶。本研究对香榧1年生枝条横切时发现，韧皮部和形成层处有单层不连续含晶韧皮纤维，含晶韧皮纤维和石细胞都属于厚壁组织，可能对香榧插穗不定根的发育有一定影响。扦插生根过程中，根据不定根发生的时间，将根原基分为潜生根原基和诱生根原基2种类型。潜伏状态的根原基在适宜环境条件下解除休眠，继续发育成不定根。诱生根原基指外植体本身不存在潜生根原基，需要诱导才能分化。香榧1年生枝条中未发现潜生根原基，因此，香榧插穗在扦插生根过程中，属诱生根原基类型。不定根按其形成部位可分为皮层生根型、愈伤组织生根型和混合生根型3种。综合分析得出，香榧扦插根原基产生于愈伤组织，不定根由愈伤组织伸出，因此，初步推断属于愈伤组织生根型。

植物体内的IAAO、PPO、POD、SOD活性与不定根的生长发育相关。POD能破坏某些阻碍插穗生根的抑制剂，被认为是生根标志之一。POD活性在扦插生根过程中会出现2个峰值，分别为根的诱导与伸长。扦插后至第1次峰值为根诱导期，随着POD活性上升，消除插穗内多余的内源IAA，此时香榧插穗基部愈伤组织已形成，在POD活性第二次峰值前，POD活性的下降有助于IAA含量的累积，促使不定根的形成，此时香榧插穗陆续生根，与桉树()中的研究结果相一致。随着不定根的伸长，POD活性又逐渐上升以促进不定根生长，这与东方杉(×)中的研究结果相一致。香榧扦插生根过程中，标典处理的POD活性高于GGR6和对照组，峰值出现早，更利于不定根的诱导与表达。

香榧插穗生根过程中，标典、GGR6处理与对照组在扦插后0～14 d PPO活性下降，此时插穗切口表面形成较薄的愈伤组织；第35天PPO活性出现峰值，此时标典和GGR6处理的插穗愈伤组织发达，覆盖整个切口，颜色为黄褐色，而对照组的愈伤组织少而薄。高活性的PPO催化酚类物质与IAA合成生根辅助因子，从而起根原基诱导作用。香榧插穗各处理PPO活性的增加，有利于生根辅助因子的合成，进而促进根原基的诱导与不定根的形成。在山杏()和榛子()的扦插生根研究中也发现了相似情况。切口愈伤组织颜色为黄褐色时，香榧对照组插穗PPO活性高于外源生长调节剂处理，说明对照需要更高的PPO活性诱导根原基的形成。扦插后45～105 d，PPO活性回到最初水平，变化趋于平缓，此时香榧插穗愈伤组织进一步生长成熟，颜色加深，表面出现圆点状凸起，少数插穗生根。扦插后105～135 d，PPO活性呈缓慢上升趋势，此时插穗陆续生根，根不断伸长，少数出现侧根。综合分析，标典与GGR6处理能缩短香榧插穗的根原基形成时间，但不能提高生根率。各处理在扦插后约一个月为愈伤组织形成和根原基诱导期，虽然能较快形成根原基，但是根原基发育并形成不定根突破愈伤组织所需时间较长，这可能与香榧插穗生根特性相关。

生长素(IAA)是促进不定根形成的主要激素。根原基的发生需要较高浓度的生长素，而根原基的伸长和生长不需要高水平的生长素。香榧插穗在扦插后0～35 d，IAAO活性急剧下降，分解IAA能力降低，促进IAA积累，为根原基的发生做准备。之后，IAAO活性上升，GGR6、标典、对照组分别在第55、75、85天达到峰值，促使IAA降解，低浓度的IAA有助于根原基的伸长和生长。香榧扦插生根过程中IAAO活性与榛子()、四倍体刺槐(Tetraploid)相接近，而榛子与四倍体刺槐扦插繁殖也都十分困难。

香榧扦插生根过程中，各处理插穗基部皮层SOD活性总体呈下降-上升趋势。在扦插初期0～14 d，对照组与GGR6处理的SOD活性上升，插穗离开树体受到创伤，切口易被氧化，水分与养分来源被切断，处于逆境状态，因此，SOD活性升高起保护作用；而标典处理SOD活性呈下降趋势，表明插穗受创细胞已修复，愈伤组织形成时间早于对照和GGR6处理。扦插第21天，插穗基部愈伤组织开始形成，SOD活性开始下降，插穗吸收水分与养分能力部分恢复；随着插穗基部愈伤组织的生长，愈伤组织颜色加深，表面出现小凸起，SOD活性又开始恢复，与扦插前枝条在树体上的活性相近，SOD的再合成能避免自由基的大量积累，增强插穗抗性。与对照组相比，施加外源生长调节剂能使插穗SOD活性长期保持在较低水平，表明其愈伤组织生长较好，吸收水分与养分避免插穗处于逆境。综合分析，SOD活性变化与香榧插穗生根有一定关系，在愈伤组织形成与根原基诱导期SOD活性呈下降趋势，标典处理能缩短插穗愈伤组织形成时间，加快不定根的诱导。

香榧扦插后0～21 d可溶性蛋白含量上升，有助于插穗内营养物质的积累，扦插后21～35 d标典与GGR6处理的插穗中可溶性蛋白含量下降，达到最低值，推测插穗根原基的诱导与形成消耗了大量营养物质。蛋白质含量与酶的合成和活性有关。扦插初期，插穗基部形成愈伤组织，细胞细嫩，生理活动旺盛，需要大量的蛋白酶参与，因而扦插初期各处理可溶性蛋白含量均成上升趋势。扦插后期，各处理可溶性蛋白含量均下降，此时插穗不定根陆续长出。随着不定根的伸长，营养物质含量有所下降，说明不定根的伸长消耗了部分营养物质。生根过程中，标典处理的可溶性蛋白含量高于GGR6处理和对照组，峰值更明显，表明标典处理更有利于插穗内营养物质的积累。综合分析，施加标典能提高插穗生根后期可溶性蛋白含量，有助于不定根的发育和生长。