杨梅树体健康状态的量化指标评价

郑锡良，梁森苗，俞浙萍，任海英，孙 鹂，林 瑞，张淑文，戚行江

(浙江省农业科学院 园艺研究所，浙江 杭州310021)

杨梅是我国南方的特色经济果树，树形优美，四季常绿；果实颜色鲜艳，富含黄酮、多酚、氨基酸等活性物质，具有抗氧化、降糖、降脂、抑制肿瘤等功能特性，深受消费者青睐。2004年以来，发现了危害杨梅产业的凋萎病，现已逐步向全国其他杨梅产区陆续扩散。杨梅凋萎病的病原菌为异色拟盘多毛孢()和小孢拟盘多毛孢()，主要定殖于杨梅枝干，也可以侵染杨梅叶片引起叶斑病，进而导致树体枝条和树干干枯，影响杨梅树体对氮、钙等营养元素的吸收和传递，降低根际菌根活力，最终导致树体死亡。近年来，研究发现杨梅产区发生了一种新病害——衰弱病，该病害多发生于盛产期果园，发病果园未见明显的发病中心。衰弱病发生后杨梅树体须根减少，韧皮部和木质部颜色加深，后期根系出现腐烂症状，病症逐年加重，直至死亡。杨梅凋萎病和衰弱病均是危害杨梅产业的重要病害，造成了严重经济损失，影响了产业持续发展。

目前，对杨梅凋萎病、衰弱病两种病害的研究主要集中在发病规律及防治策略方面，对两种病害的判断和区别主要以树体表现凭经验进行鉴别，受主观因素影响较大，不利于采取准确防治措施。由此，本研究拟通过多年经验总结健康、衰弱病、凋萎病树体的典型表现，测定不同状态树的根、枝条、叶片、花芽等组织的多种生理指标，以及叶片拟盘多毛孢()ITS序列()相对表达量等数据，筛选不同状态树的显著差异指标，用于评价不同状态树的量化指标，旨在为准确鉴别杨梅树健康状态提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2021年1月，分别在浙江文成、青田、仙居、兰溪、上虞等杨梅产区代表性果园(果园管理水平中等)，开展健康、衰弱病、凋萎病杨梅树调查与取样，品种为东魁；采集树冠滴水线附近根系、一年生枝条、成熟叶片、花芽等不同组织样品(表1)，每个样品含3个重复，每重复中花芽样本5 g左右，其余组织样本10 g以上；样品采集后置于干冰中保存，带回实验室后置于-20 ℃冰箱中保存，用于后续实验。叶绿素相对含量(SPAD)采用美能达的SPAD-502叶绿素仪测定，每份样品测定10片叶子。

表1 杨梅样本采集信息

1.2 指标测定

采用分光光度法测定不同组织的CAT活性、HO含量、LPO含量、MDA含量、SOD活性、POD活性、DHA含量，组织样品经不同测定指标对应的试剂盒(购自苏州科铭生物技术有限公司)处理(参考试剂盒说明书)后进行测定，每样本设置3次重复测定。

1.3 PvITS序列相对表达量分析

利用上述健康、衰弱病和凋萎病的树体叶片，利用CTAB-KAc法提取叶片和拟盘多毛孢混合RNA。使用天根的TIANScript ll cDNA第一链合成试剂盒反转录，获得混合cDNA；利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)原理，建立了序列相对表达量直接测定方法：以混合cDNA为模板，采用任海英等研究中定量引物Pvm1L和Pvm1R，以持家基因为内参基因设计引物MyTUB2_qF和MyTUB2_qR(表2)，采用天根FastFire qPCR Premix(SYBR Green)试剂盒进行qRT-PCR反应，采用10 μL反应体系：cDNA模板1 μL，正向引物0.5 μL，反向引物0.5 μL，2×FastFire qPCR PreMix 5 μL，RNase-Free ddHO 3 μL；反应程序为：预变性95 ℃ 1 min；变性95 ℃ 5 s，退火55 ℃ 10 s，延伸72 ℃ 15 s，38 个循环。

表2 qRT-PCR引物序列

1.4 数据分析

以内参基因对应的C值，对所有qRT-PCR反应进行标准化计算，并通过公式2-ΔΔC获得不同样本的相对表达量。利用箱式分析法计算酶活、相对表达量的上四分位数()、中位数()、下四分位数()，四分位区间(inter-quartile range，)=-，下异常值=-1.5，上异常值=+1.5，公式计算、图形绘制使用Excel 2016软件进行。

2 结果与分析

2.1 健康、衰弱病和凋萎病的树体典型表现

通过在浙江杨梅主产区的调查发现：健康树根系发达、新根生长明显，叶片浓绿，叶绿素相对含量(SPAD)在35.0～50.8，新梢分春、夏、秋季等不同时期正常抽生、树体健壮，常规管理、正常年份条件下，年度结果数量无明显增减幅度，果实颜色鲜艳，酸甜适口，树体寿命可长达百年(图1-a)。

衰弱病树大部分老、熟叶片脱落，只存留顶端外围少量暗绿、发黄、无光泽的叶片，SPAD在25.2～37.5，新梢抽生困难，结果量增多，果实小而酸，品质差，发病2～4 a后树体死亡，无明显集中暴发期，为非侵染性病害，无法通过观测气候因素建立测报模型进行预测(图1-b)。

凋萎病树，发病初期树体上冠部枝梢出现零星叶片急性青枯，SPAD在20.1～44.3，始现病症多数在幼嫩枝梢中上部位，顶部、外围枝条及内膛枝均有不同程度的发生，症状初现时叶片青枯、凋而不落；树干以及根的木质部变褐色；翌年春季发病症状减轻，甚至可正常抽梢生长与结果。主要在夏末秋初开始出现病症，于9月至翌年3—4月集中暴发；由此反复2～3 a后，伴随枝干韧皮部开裂，根系枯死，树体死亡(图1-c)。

a，健康树体；b，衰弱病树体；c，凋萎病树体。a， Healthy tree； b， Decline tree； c， Twig blight tree.图1 不同杨梅树体状态表现Fig.1 Different status performance of Chinese bayberry trees

2.2 健康、衰弱病、凋萎病树体不同组织的活性指标分析

健康、衰弱病、凋萎病状态间枝条CAT活性分别在27.12～79.10 nmol·min·g、31.64～79.10 nmol·min·g、33.90～89.27 nmol·min·g；根CAT活性分别在117.52～386.46 nmol·min·g、46.71～225.43 nmol·min·g、47.46～220.91 nmol·min·g；在箱式图和异常值分析中发现(图2-a)，枝条和根CAT活性在健康与其他两种树体间均存在极显著性差异(0.001≤<0.01)，但是枝条CAT活性在健康与其他树体状态间，指标有数值范围重叠，不适于作为明显区别指标；而根CAT活性在去除异常值后健康树体分布范围为：117.52～280.67 nmol·min·g，其余两种树体为46.71～225.43 nmol·min·g，数据重叠范围相对较小，可作为辅助判断树体健康与否的指标。

健康、衰弱病、凋萎病3种状态的叶片HO含量分别在335.04～665.58 μmol·g、482.89～978.91 μmol·g、502.54～794.89 μmol·g；枝条HO含量分别在77.54～174.35 μmol·g、119.89～276.82 μmol·g、115.25～268.88 μmol·g；健康叶片和枝条HO含量极显著性低于其他两种树体指标(图2-b)，而根和花芽HO指标在3种状态间无显著性差异。

表3 杨梅不同树体状态和组织的CAT活性和H2O2含量

健康、衰弱病、凋萎病3种状态叶片LPO含量、枝条LPO含量、花芽LPO含量在不同树体状态间均无显著差异。根LPO含量分别在252.63～587.64、255.67～592.91、153.75～727.04 nmol·g，健康树体中指标显著性低于其他两种树体状态(图3-a和表4)(0.01≤<0.05)。根SOD活性、花芽SOD活性在不同树体状态间无显著性差异。叶片SOD活性分别在450.71～910.21、625.45～1 012.98、608.97～996.68 U·g，枝条SOD活性分别在484.20～804.99、745.79～1 621.98、831.63～1 297.36 U·g，叶片和枝条SOD活性在健康与其他两种状态间均存在极显著性差异(<0.001)，尤其枝条SOD活性可作为辅助判断树体健康与否的指标(图3-b)。

*、**、***分别代表健康与其他两种状态间均存在显著性、极显著性差异(0.01≤P<0.05、0.001≤P<0.01、P<0.001)。下同。*， **， *** represent that there are significant and extremely significant differences between healthy and the other two status (0.01≤P<0.05， 0.001≤P<0.01， P<0.001) ， respectively. The same as below.图2 杨梅不同树体状态和组织的CAT活性和H2O2含量的差异显著性分析Fig.2 Analysis of significant difference of CAT activity and H2O2 content of different tissues in different status of Chinese bayberry

健康、衰弱病、凋萎病3种状态的叶片MDA含量、枝条MDA含量、花芽MDA含量在不同树体间无显著性差异。根MDA含量分别在23.56～59.10 nmol·g、35.43～78.00 nmol·g、30.01～75.34 nmol·g，健康树体指标极显著性高于其他两种树体 (0.01≤<0.05)(图4-a和表5)。三种状态的根DHA含量分别在1.02～1.59 μg·min·g(去除异常值后范围为1.02～1.58 μg·min·g)、0.42～0.78 μg·min·g、0.37～0.73 μg·min·g(图4-b和表5)，且健康树体指标极显著高于其他两种树体(<0.001)，可作为辅助判断树体健康与否的指标。

表4 杨梅不同树体状态和组织的LPO含量和SOD活性

图3 杨梅不同树体状态和组织的LPO含量和SOD活性的差异显著性分析Fig.3 Analysis of significant difference of LPO content SOD activity of different tissues in different status of Chinese bayberry

表5 杨梅不同树体状态和组织的MDA和DHA含量

2.3 杨梅叶片PvITS相对表达量分析

根CAT活性、叶片HO含量、叶片和枝条SOD活性、根DHA含量等指标在衰弱病与凋萎病树体中无显著性差异，表明上述指标不适于区别衰弱病和凋萎病的树体状态，还需借助qRT-PCR等手段进行判断或区分。因此，本研究对3种树体叶片的相对表达量进行了qRT-PCR分析，结果如表6所示：健康相对表达量在0.78～1.15，中位数()为1.00。衰弱病相对表达量在1.01～9.23，异常值为<1.76和>3.91的数值，去掉异常值后，相对表达量应为1.76～3.91，为2.73。凋萎病相对表达量在3.39～99.04，异常值为<9.54和>29.62的数值，去掉异常值后，相对表达量应为9.54～29.62，为16.56。3种树体相对表达量间均存在极显著性差异，因此，叶片相对表达量可作为判断健康、衰弱病、凋萎病树体状态的量化指标。

图4 杨梅不同树体状态和组织的MDA和DHA含量的差异显著性分析Fig.4 Analysis of significant difference of MDA and DHA content of different tissues in different status of Chinese bayberry

表6 杨梅叶片拟盘多毛孢菌ITS序列的相对表达量

3 讨论

CAT广泛存在于植物体中，在活性氧清除系统中具有重要作用，可显著抑制根霉菌()活性。SOD能够特异性地清除超氧阴离子，保护机体免受氧化损伤，是广泛存在于各生物体中的重要金属酶，能够防治桃褐腐病等真菌性病害，是参与植物抗病的一种重要的酶，并与木质素及抗病毒素的合成有关，还可以增强植株对各种病原菌的抵抗力，可以被用作鉴定植物抗病性的生化标记。DHA通过脱氢抗坏血酸还原酶还原为抗坏血酸(AsA)，进而参与植物自身的氧化应激反应，在植物抵抗氧化胁迫中具有重要作用，是根系活力的重要表现。前人研究发现，酵母菌()、镰刀菌()等真菌侵染植物，可引起CAT、SOD、POD等酶的活性变化，防御病原菌的侵染，提高植株抗性。本研究发现，健康与衰弱病、凋萎病树体根CAT活性、枝条SOD活性、根DHA含量间均存在极显著性差异，数据重叠范围较小，通过去除异常值后，健康树体与衰弱病、凋萎病树体根CAT活性分别为117.52～280.67 nmol·min·g与46.71～225.43 nmol·min·g、枝条SOD活性分别为484.20～804.99 U·g与745.79～1 621.98 U·g、根DHA含量分布分别为1.02～1.58 μg·min·g与0.37～0.78 μg·min·g，是适合用于评价杨梅树健康与否的量化指标。结合前期研究发现，凋萎病与衰弱病两种树体的微生物菌落结构发生了变化，导致了树体自身的防御酶系统发生了变化，导致了枝条SOD活性增加，与前人研究结果一致，可成为鉴定杨梅病害的重要标志物；根系CAT与DHA活性降低，表明两种树体状态的根系活力明显降低，建议重点针对根部采取复壮措施，进而达到恢复树势效果。

利用qRT-PCR方法测定叶片的相对表达量，发现健康、衰弱病、凋萎病分布范围分别是0.78～1.15、1.76～3.91、9.54～29.62，且两两间均存在极显著性差异(0.01≤<0.001)，数值间差异无重叠，是一种快速、受主观因素影响较小的，可用于区别3种树体状态的量化指标。任海英等研究表明，杨梅凋萎病树体中拟盘多毛孢和小拟盘多毛孢等内生真菌的丰度远高于健康树体，拟盘多毛孢和小拟盘多毛孢丰度增加是引发凋萎病发生的病因，是凋萎病的病原菌；本研究中凋萎病树叶片的相对表达量远高于衰弱病和健康树体，与前人研究结论一致，也表明凋萎病病原菌丰度增加不是引发衰弱病的直接病因，两种病害有本质区别，需针对具体病因研发不同的防治措施。同时，结合健康树具有新根生长明显、叶片浓绿、新梢正常抽生、果实颜色鲜艳等外观表现；衰弱病树具有叶片异常脱落，存留叶片暗绿、发黄、无光泽，新梢抽生困难，结果量增多，果实小而酸，无明显集中暴发期等典型外观表现；凋萎病树具有幼嫩枝梢中上部叶片急性青枯、凋而不落，翌年春季发病症状减轻，甚至可正常抽梢生长与结果，于9月至翌年3—4月集中暴发等典型表现，可更为准确判断杨梅树体3种健康状态。本文仅用“衰弱病”和“凋萎病”两种病害的生化与指标，不能代表其他病害树体状态，因此，其他病害树体状态的量化评价需进一步研究验证。

4 结论

根CAT活性、根DHA含量、枝条SOD活性及叶片相对表达量可作为区分杨梅树体状态的量化指标，辅助评价树体健康与否的参考阈值分别为117.52～280.67 nmol·min·g、1.02～1.58 μg·min·g、484.20～804.99 U·g和0.78～1.15。相对表达量辅助评价衰弱病与凋萎病的参考阈值分别为1.76～3.91、9.54～29.62，与树体表现相结合，理论上可更准确评价杨梅健康状态。