致病疫霉效应蛋白寄主靶标的筛选及其功能分析*

杨骐瑞， 王娜， 李丽华， 邱艾， 余永飞， 吴骏， 刘晶

(云南师范大学 生命科学学院，云南省马铃薯生物学重点实验室，云南省高校马铃薯生物学重点实验室，云南 昆明 650500)

马铃薯(SolanumtuberosumL.)是茄科茄属作物，其营养全面且口感佳，在全世界范围内被广泛种植，是世界四大粮食作物之一[1].马铃薯自传入我国以来便在全国范围内大量种植并深受人们喜爱.然而，马铃薯生长过程中往往会遭遇各种病害，其中晚疫病是马铃薯生产中的毁灭性病害.马铃薯晚疫病由病原卵菌致病疫霉(Phytophthorainfestans)引起，会导致马铃薯产量急剧下降甚至绝收，严重威胁全球粮食安全.

病原菌在侵染植物过程中往往会分泌效应蛋白到植物中帮助其成功侵染.同时，植物也进化出了相应的抗病蛋白，当抗病蛋白识别病原菌的效应蛋白后，植物的特异性免疫反应(Effector-triggered Immunity,ETI)被激活，引起植物局部产生过敏性坏死反应(Hypersensitive Response,HR)，HR反应能够将病原菌限制在植物的局部特定区域来抵抗病原菌入侵，从而确保植物的正常生长发育[2-3].致病疫霉是疫霉属(Phytophthora)的卵菌，据报道其基因组中有563 个RxLR胞质效应蛋白基因，其中有100多个效应蛋白基因能够在植物体内表达并调控[4].典型的RxLR效应蛋白含有信号肽、N端RxLR(Arg-x-Leu-Arg)保守结构域和C端功能域三个结构域[5-6].信号肽在RxLR效应蛋白的N端，由15～25个疏水性氨基酸残基组成，负责将效应蛋白分泌到细胞外，成熟效应蛋白的信号肽会被切除.保守的RxLR结构域能够帮助效应蛋白转运到植物细胞中.效应蛋白的C端功能域包含K、W、Y和L 四个模式基序，该区域的序列多态性较高，这些结构域对效应蛋白的无毒功能及在抑制宿主细胞死亡过程中发挥重要作用[5].

RxLR效应蛋白被病原菌分泌到寄主植物细胞内并与植物细胞内的靶标蛋白结合，干扰植物的免疫反应.目前，关于致病疫霉效应蛋白的植物靶标蛋白已有不少文献报道，如Ren等人的研究表明，致病疫霉效应蛋白Pi22926能够靶标马铃薯丝裂原活化蛋白激酶StMAP3Kβ2，前者通过特异与后者的激酶结构域互作来抑制马铃薯免疫应答信号传导[6].致病疫霉效应蛋白Pi02860可与马铃薯E3泛素连接酶StNRL1互作，促进病原菌的侵染[7].Boevink等研究发现，马铃薯蛋白磷酸酶PP1c是致病疫霉效应蛋白Pi04314的靶标蛋白，PP1c的磷酸酶活性对促进病原菌的侵染至关重要，当二者互作时PP1c的亚细胞定位发生改变，进而帮助病原菌成功侵染[8].Wang等研究表明，马铃薯RNA结合蛋白StKRBP1能够结合致病疫霉效应蛋白Pi04089，突变StKRBP1的保守基序后不能再促进病原菌的侵染，证明StKRBP1负调控马铃薯的抗病免疫反应[9].致病疫霉效应蛋白PexRD2 能够靶标植物MAPK激酶MAPKKKε并与之互作，通过抑制MAPKKKε的磷酸化来抑制植物抗病信号传导[10].还有研究发现，Avr3a能够靶标参与细胞内吞的GTPase DRP2，进而抑制植物活性氧的积累[11].综上所述，筛选并研究效应蛋白的植物靶标蛋白，解析靶标蛋白在植物免疫应答过程中发挥的功能对后续选育作物抗病品种具有重要意义.

课题组前期研究发现一个致病疫霉RxLR效应蛋白PITG_16275并命名为Pi16275，在本氏烟草叶片上瞬时超量表达该效应蛋白能够促进致病疫霉的侵染.研究利用Pi16275作为诱饵蛋白，筛选酵母cDNA文库获得Pi16275的植物靶标蛋白，利用病毒介导的基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)体系在烟草中瞬时沉默靶标蛋白同源基因，并对靶标蛋白的功能做了初步研究.

1 材料与方法

1.1 实验材料

致病疫霉菌株88069、大肠杆菌菌株DH5α、根癌农杆菌菌株GV3101、酿酒酵母菌菌株Y187及Y2HGold均由本实验室保存提供.本氏烟草种植于人工恒温气候室中(22 °C，16 h/8 h 光照/黑暗)，生长3～6周后备用.酵母双杂交载体pGBKT7和pGADT7，VIGS载体pTRV1、pTRV2-GFP、pTRV2-PDS和pTRV2 均由本实验室保存提供.酵母cDNA文库由本实验室提供，文库材料来源于致病疫霉菌株88069侵染不同时间的马铃薯栽培种C88叶片.

1.2 酵母cDNA文库筛选及酵母点对点杂交

以致病疫霉cDNA为模版，利用引物对(见表1)扩增不含信号肽序列的Pi16275编码序列，利用One Step Cloning Kit (Vazyme)将扩增序列连接到酶切后的pGBKT7载体上，形成重组载体pGBKT7-Pi16275.随后将重组载体转入DH5α中，菌落PCR鉴定后送测序，确认重组载体序列正确无误后用于酵母cDNA文库筛选，具体操作步骤参照韦吉的方法[12].随后，利用引物对(见表1)以马铃薯栽培种C88的cDNA为模版，扩增上述酵母cDNA文库筛选出的候选互作蛋白X的编码序列，利用相同方法将X的编码序列连接到酶切后的pGADT7载体上，形成重组载体pGADT7-X.最后，利用酵母点对点杂交技术验证候选互作蛋白X与Pi16275是否真正存在互作.实验设置3次生物学重复.

1.3 病毒介导的基因沉默(VIGS)及沉默植株抗病性分析

利用引物对(见表1)以本氏烟草cDNA为模版，扩增X在本氏烟草中同源蛋白的编码序列并连接到酶切后的pTRV2载体上，形成重组载体pTRV2-X′.将上述重组载体转入DH5α中，PCR鉴定及测序结果确认重组载体正确后，提取质粒并转化GV3101，PCR鉴定正确后用于VIGS实验.VIGS具体操作步骤参照文献[13]的方法.利用RT-qPCR技术检测目的基因的沉默效率，同时利用离体叶片接种法对本氏烟草进行抗病性分析.选取本氏烟草顶叶以下第3～5片叶片，采用离体叶片接种法在主叶脉两侧各接种10 μL浓度为2×105个/mL的致病疫霉孢子囊悬浮液.保湿培养6 d后，测量病斑大小,计算病斑面积.实验设置3次生物学重复.

表1 研究中使用到的引物

2 结果与分析

2.1 诱饵蛋白毒性和自激活检测

构建诱饵载体pGBKT7-Pi16275，并进行毒性及自激活检测，确定诱饵蛋白对酵母生长无毒性且不会引起酵母自激活后，再进行酵母cDNA文库筛选.分别将载体组合转化酵母Y2HGold菌株，并涂布筛选平板.载体组合如下：阳性对照组(pGADT7-T与pGBKT7-53)、阴性对照组(pGADT7-T与pGBKT7-Lam)、空白载体组(pGADT7与pGBKT7)、实验组(pGADT7与pGBKT7-Pi16275).研究发现所有酵母转化菌株都能在SD-Trp(一缺)培养基上生长，实验组的酵母菌落数量及菌落大小与阳性对照组、阴性对照组及空白载体组均没有明显差异.说明诱饵蛋白对酵母细胞无毒性(图片未展示).此外，不同载体组合的酵母转化菌株均能在SD-Trp-Leu/X-α-gal(二缺)培养基上生长，且除阳性对照组外，其余酵母转化菌株在上述培养基上均不显蓝色；阳性对照组能够在SD-Trp-Leu-His/X-α-gal(三缺)培养基上生长且显蓝色，但其余组均不能在上述培养基上生长(图1).该结果说明，诱饵蛋白不存在自激活，可以进行酵母cDNA文库筛选.

2.2 酵母cDNA文库筛选互作蛋白

课题组前期构建了酵母cDNA文库，此次以Pi16275作为诱饵蛋白，筛选其互作蛋白.挑取能够在四缺培养基上生长并且显蓝色的阳性酵母菌落，液体培养后提取质粒并送生物公司测序.测序结果返回后，在NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)上进行BLAST比对分析.排除相同序列后，得到8个可能与Pi16275有互作的候选靶标蛋白(表2).

表2 候选靶标蛋白编码基因测序比对结果

2.3 酵母点对点杂交验证

以马铃薯栽培种C88的cDNA为模版，设计引物扩增上述候选靶标蛋白基因的全长编码序列，将这些序列分别连接到pGADT7 载体上构建成猎物载体.随后，利用质粒共转法，将诱饵载体与猎物载体分别共转化酵母Y2HGold菌株并涂布到酵母营养缺陷型培养基上.结果显示，除阳性对照、BD-Pi16275+AD-5组合和BD-Pi16275+AD-7组合能够在四缺培养基上生长并显蓝色外，其余组合在四缺培养基上均没有菌落生长(图2).挑取阳性对照、阴性对照及两组能够在四缺平板上生长并显蓝色的菌落制备成菌液，点样于二缺及四缺平板上.所得结果与上述结果一致，阳性对照、BD-Pi16275+AD-5组合及BD-Pi16275+AD-7组合均能在四缺培养基上生长并显蓝色(图3).说明5号及7号靶标蛋白能够与效应蛋白Pi16275产生互作.序列比对结果显示，5号靶标蛋白为3,4-二羟基-2-丁酮激酶，7号靶标蛋白为一个未知蛋白(表2).

2.4 VIGS沉默靶标蛋白基因及基因沉默植株抗病性检测

利用VIGS技术在本氏烟草中瞬时沉默5号及7号靶标蛋白基因的烟草同源基因，以注射绿色荧光蛋白(GFP)的本氏烟草植株作为阴性对照，以瞬时沉默八氢番茄红素脱氢酶基因(PDS)的植株作为阳性对照.农杆菌共注射烟草植株约10 d左右，阳性对照植株顶叶开始出现白化现象，约25 d后，阳性对照植株叶片的白化现象极为明显，说明整个实验体系正确(图4).

图4 阳性对照植株的白化现象

提取农杆菌注射25 d后的阴性对照组植株以及两个实验组植株的RNA，反转录成cDNA后进行RT-qPCR检测.结果表明，实验组烟草叶片目的基因沉默效率分别为54%及39%(图5C).收集阴性对照组及实验组的烟草叶片，接种致病疫霉孢子囊悬浮液，6 d后统计各组病斑面积.结果显示，沉默5号靶标蛋白基因在本氏烟草中的同源基因后，本氏烟草对致病疫霉的抗性显著降低，叶片病斑面积显著大于阴性对照组的病斑面积(图5A和5B)；沉默7号靶标蛋白基因在本氏烟草中的同源基因后，叶片病斑面积与阴性对照组相比无显著差异.上述结果说明，Pi16275在马铃薯中的5号靶标蛋白在植物抗病免疫过程中发挥正调控作用.

3 讨论

致病疫霉是引起世界范围内马铃薯晚疫病的重要病原菌，该病危害程度大，使用化学药物很难根治.因此，可从致病疫霉侵染马铃薯时分泌的效应蛋白着手，筛选效应蛋白的植物靶标蛋白，解析靶标蛋白在马铃薯抗病免疫应答中的作用，为后续选育马铃薯抗病品种奠定理论基础.研究以致病疫霉RxLR效应蛋白Pi16275作为诱饵蛋白，筛选得到2个与之互作的植物靶标蛋白(5号及7号).然后利用VIGS技术沉默靶标蛋白在本氏烟草中的同源基因，发现沉默5号靶标蛋白基因的同源基因后，本氏烟草的抗病能力显著降低，表明该靶标蛋白在植物抗病免疫过程中发挥一定作用.

前人研究发现，致病疫霉效应蛋白AVR2能够与马铃薯磷酸酶StBSL1结合形成复合体并被抗病蛋白Rpi-R2识别，进而引发一系列抗病反应[13].致病疫霉效应蛋白AVRblb2能够与马铃薯免疫相关蛋白酶—类似木瓜蛋白酶的半胱氨酸蛋白酶C14互作，从而抑制了C14 转运到质外体，最终导致病原菌成功侵染[14].致病疫霉效应蛋白AVR1靶标植物胞泌复合体亚基Sec5，AVR1与Sec5结合后影响植物细胞囊泡运输，进而抑制了植物基础免疫，导致植物感病[15].目前，有关效应蛋白的植物互作靶标蛋白研究多集中在泛素化系统、免疫相关蛋白酶、MAPK 信号传导、转录因子和植物基础免疫等几个方面，是否有新的重要成员参与上述过程目前还不知晓.此次研究发现了一个致病疫霉效应蛋白Pi16275的植物靶标蛋白(5号靶标蛋白)，该蛋白在植物抵御病原菌侵染过程中发挥作用.后续可从该靶标蛋白入手，深入解析该蛋白与效应蛋白Pi16275的作用机制，揭示该蛋白参与植物抗病免疫应答的可能作用方式.