干红葡萄酒生产中乙醛的形成及其分析方法研究进展

钟 轲，崔晓倩，孙雨航，马 岩，赵新节，代玲敏，韩国民

（齐鲁工业大学（山东省科学院）生物工程学院，山东济南 250353）

葡萄酒是用新鲜葡萄作为原料，通过发酵酿制而成的酒精饮料，风味和品质在很大程度上由发酵过程中产生的脂类、醛类和醇类所决定。乙醛是最重要的醛类风味化合物之一，对葡萄酒的香气、颜色稳定性和风格有着重要影响。在不同类型的葡萄酒中，乙醛含量有所不同，例如在红葡萄酒中乙醛含量一般为4～212 mg/L，白葡萄酒中乙醛含量为11～494 mg/L，雪莉酒中乙醛含量高达90500 mg/L。低浓度的乙醛具有一种愉快的水果香气，高浓度的乙醛会产生类似青草或青苹果的异味。

在干红葡萄酒陈酿过程中，乙醛与酚类物质发生反应，使葡萄酒的化学成分和感官特性不断变化，影响葡萄酒的颜色、酒体及涩味。最重要的反应之一是在乙醛桥联作用下花青素和花青素、花青素和黄烷醇以及黄烷醇和黄烷醇的聚合反应，不但可以促进单宁的缩合，减少蛋白质-单宁在葡萄酒中的沉淀，提升葡萄酒的品质，还可以加强不稳定的单体花青素聚合生成稳定的衍生色素，随着时间的推移合理地稳定红葡萄酒的颜色。颜色是葡萄酒最直观的感官属性，决定葡萄酒的品质。高品质的葡萄酒通常需要一定时间的陈酿，陈酿过程中乙醛介导的衍生色素易抵抗氧化反应、聚合反应和二氧化硫漂白的影响，形成稳定的色素，对维持葡萄酒颜色稳定性、提升葡萄酒的价值具有重要意义。

乙醛在葡萄酒生产中主要通过微生物代谢和化学氧化两种途径生成。酵母的生物代谢产生乙醛的速率相对较快，多项研究显示不同的酵母菌株产乙醛能力具有显著性差异，因此在葡萄酒生产阶段通过精确控制工艺环节管理酵母代谢产乙醛的能力值得探讨。化学氧化形成乙醛是基于芬顿反应生成的羟基自由基，该反应离不开氧气，因此葡萄酒生产中的氧气管理尤为重要。基于乙醛在葡萄酒生产中的重要作用，乙醛的分析检测日益受到关注，由于乙醛具有强挥发性，作为中间产物不断地生成与消耗，对其进行检测并精确定量是控制葡萄酒质量的重点与难点。本文归纳了葡萄酒生产中乙醛的生成途径，对比了液相色谱法、气相色谱法、电泳法和酶法等检测方法，以期为葡萄酒生产工艺的改进及产品质量控制提供参考。

1 葡萄酒中乙醛的生成

1.1 乙醇化学氧化生成乙醛

红葡萄酒的感官特征主要取决于酚类化合物的类型和数量，类黄酮是主要的酚类化合物，也是陈酿过程中发生氧化反应的重要成分，影响着葡萄酒的颜色和涩味。葡萄酒曝氧水平影响酚类组成，低水平氧化有利于乙醛和总酚缩合，减少葡萄酒中蛋白质-单宁沉淀，改善口感，增加聚合色素，稳定颜色，从而提高葡萄酒的品质；过度氧化会导致葡萄酒失去新鲜度，形成某些不良风味，加速葡萄酒的变质。葡萄酒的氧化反应主要涉及多酚、氧气、金属离子和二氧化硫等，研究表明，用亚铁氰化钾去除铁离子和铜离子会显著降低葡萄酒与氧气的反应速率，同时，当反应体系中没有铁离子和铜离子时，不会发生显著的氧化反应，单独的铁离子产生相对较弱的催化效果，铁离子和铜离子结合时，能观察到明显的协同作用。氧气不能直接参与葡萄酒的氧化反应，只有在铁离子的催化作用下才能与葡萄酒中的酚类物质反应，微量的铜能有效增强这种催化作用。目前普遍认为葡萄酒的氧化分为四步：①三重态的氧分子不能直接与单重态的有机化合物直接反应，但氧气可以通过铜、铁离子的催化作用来接受电子；②金属离子催化作用下酚类化合物被氧化成醌，氧气被还原为过氧化氢；③亚铁和亚铜在芬顿反应中与过氧化氢反应，产生活泼的氧化剂羟基自由基；④羟基自由基具有极强的氧化性，迅速氧化葡萄酒中大多数有机物。葡萄酒中乙醇含量仅次于水，远多于其他化学成分，因此，乙醇与羟基自由基相遇时立刻被氧化成乙醛，如图1 所示，对葡萄酒的感官和风味产生重要影响。在葡萄酒中，二氧化硫与氧和多酚的相互作用也十分复杂，亚硫酸盐作为自由基清除剂会阻止多酚的氧化，但亚硫酸盐会与过氧化氢反应，与醌反应，显著加速酚与氧的反应速度。鉴于二氧化硫的抗氧化作用，根据葡萄酒中可用二氧化硫的含量以及氧化过程中二氧化硫的消耗量，葡萄酒以不同的化学反应模式完成氧气的消耗：①“前二氧化硫”模式，氧气在饱和状态下被迅速消耗，可用的二氧化硫消耗量很小；②“正常”模式，二氧化硫既还原醌又去除过氧化氢，二氧化硫的消耗量大；③“后二氧化硫”模式，游离态二氧化硫在前期氧化过程中被耗尽，不能快速消除芬顿反应形成的过氧化氢，但结合态二氧化硫的裂解可以释放出游离态二氧化硫，醛和二氧化硫的结合态化合物最容易裂解，因此，醛和二氧化硫结合态占总二氧化硫结合态的比率决定了游离二氧化硫的释放速率，进而影响葡萄酒的氧化速率。

图1 乙醇氧化生成乙醛反应

1.2 酵母代谢

在葡萄酒发酵过程中，乙醛含量升高不仅是因为葡萄酒的化学氧化，微生物的新陈代谢也会产生乙醛。乙醛通常在酒精发酵初期达到峰值，在发酵过程中，葡萄糖利用协助扩散进入酵母细胞，经糖酵解途径转化为丙酮酸，在丙酮酸脱羧酶的作用下生成乙醛和二氧化碳，乙醛在乙醇脱氢酶的作用下生成乙醇，并且将NADH 氧化为NAD，这一步骤对于维持细胞内氧化还原平衡至关重要。发酵过程中产生的辛酸和癸酸是导致葡萄酒发酵提前停止的原因，添加适量乙醛能刺激酵母生长，在滞后期和早期指数阶段，酿酒酵母能快速代谢所添加的乙醛。酵母受加氧的刺激，可以通过多种代谢途径消耗氧气，包括有氧呼吸、脂质代谢、金属离子吸收和脂肪酸合成等，不仅可以减少硫化物的产生，还可以赋予酵母更高的耐酒精性和发酵活性。乙醛是乙酸、丙酮和α-乙酰乳酸的前体物质，可进一步反应生成乙酮和2,3-丁二醇等多种副产物，图2 列出了酵母酒精发酵过程中乙醛的来源与消耗代谢途径。

图2 酵母酒精发酵过程中乙醛代谢途径

微氧化是一种向葡萄酒中通入微量连续的可控氧气的技术，目的与本质是模拟葡萄酒在橡木桶中的氧化，加速葡萄酒陈酿。由于乙醛是葡萄酒化学氧化的主要产物，被作为氧化指示剂来评估葡萄酒微氧过程中的氧化程度。多项研究显示，在葡萄酒发酵后处理阶段使用微氧处理，能够刺激葡萄酒中残留酵母的生长，消耗更多氧气，酵母数量增多的同时伴随着乙醛水平的增加；微氧化会促进残留酵母消耗更多的二氧化硫，二氧化硫的损失又导致了酵母种群的增多，与氧气消耗和乙醛的急剧增加有关。当酒精发酵结束后糖源较低时（残糖＞3 g/L），残留酵母在好氧环境下利用乙醇作为替代底物，将其氧化为乙醛，残糖越高酵母的存活能力增强。研究证实这种生物代谢产乙醛的速率远大于化学氧化产乙醛的速率。雪莉酒是酵母在氧气的存在下作用于干酒，将乙醇氧化为乙醛制成的，在葡萄酒发酵后处理阶段，酿酒酵母的活性在雪莉酒的生产中得到充分验证。因此，在葡萄酒发酵后处理阶段适时补充微量氧气，可以促进酵母生长，积累适量乙醛。综上，葡萄酒进行微氧处理时应该综合考虑残糖和二氧化硫水平，重点关注微生物的新陈代谢，未来可以采用生物代谢替代化学氧化产乙醛的方式加速葡萄酒的陈酿。

2 乙醛的分析检测方法

在葡萄酒发酵过程中，乙醛能强烈结合（Kd=2.06×10）二氧化硫。二氧化硫的功能十分复杂，有抗菌和抗氧化的作用，还可以与羰基化合物结合，对葡萄酒风味起修饰作用。葡萄酒正常pH值（3 到4 之间）时，二氧化硫主要以亚硫酸氢盐离子的形式存在，能迅速与游离乙醛反应生成无味的α-羟基磺酸盐，形成较稳定的乙醛-二氧化硫亚硫酸加成物，从而减少游离态乙醛和二氧化硫数量。与亚硫酸盐的情况类似，对乙醛的定量分析也分为“游离乙醛”和“结合乙醛”，这两种形式的总和即葡萄酒中存在的总乙醛。总乙醛的分析方法一直都是实验室的重点和难点，解离α-羟基磺酸盐释放游离态乙醛对检测葡萄酒中总乙醛的定量分析至关重要。

高效液相色谱法（HPLC）和气相色谱法（GC）常应用于液体样品中乙醛的测定，这些分析仪器具有很高的灵敏度和选择性，可以检测混合物中的微量乙醛浓度。酶法、电泳法、蒸馏法或与亚硫酸氢盐反应法、比色法及薄层色谱法也可应用于羰基化合物的分析检测，但蒸馏法或与亚硫酸氢盐反应法、比色法及薄层色谱法灵敏度较差。下面以液相色谱法、气相色谱法、酶法和电泳法为例，进行葡萄酒乙醛分析方法的详细介绍。

2.1 液相色谱法

在现有文献中，对乙醛含量的检测多采用液相色谱法，因其具有灵敏度高、选择性好、不受挥发性物质影响等优点，在食品检测行业广泛应用。众所周知，乙醛的检测通常需要衍生化，2,4-二硝基苯肼（DNPH）和丹磺酰肼(DNSH)是两种常见的肼衍生剂，DNPH 是最广泛使用的衍生试剂，可以选择性的与醛反应生成稳定的腙。在酸性介质中，DNPH 与醛的碳原子反应形成双键，生成化合物2,4-二硝基苯腙，在360 nm 处有着最佳吸收波长，可以通过液相色谱法分离并通过紫外分光光度法检测。使用液相色谱法工作时，酸化的有机相可以将腙衍生物保留在溶液中，如乙腈和高氯酸，随后以水和乙腈作为流动相，在C色谱柱上进行梯度洗脱。

在葡萄酒中，样品pH值是影响乙醛与亚硫酸氢根结合的关键因素。当溶液pH 值低于1（pKa1，1.85）或高于8（pKa2，7.2）时，羰基化合物与二氧化硫的结合物会分裂，高pH 值更有利于这一分裂反应。强碱环境会加速葡萄酒的氧化形成额外的乙醛，因此乙醛分析过程中杜绝氧化反应的发生尤为重要。现有文献中关于杜绝氧化反应可以利用氮气脱氧，根据Elias 等的报道，利用氮气吹扫和顶空包覆可以防止苯酚氧化，缺点是耗时较长，需要至少30 min 的脱气；避免氧化的另一方法是加入金属螯合剂，根据Jackowetz 等的报道，在样品中加入EDTA 与金属螯合，一定程度上阻止了羟基自由基的形成，防止乙醇氧化生成乙醛，消除了厌氧样品处理的需要。基于此原理，区硕俊等在加入EDTA 抑制铜离子催化的同时，对乙醇进行甲基化处理去除部分乙醇，并且采用氮气保护，利用3 种脱氧方式抑制乙醇氧化生成乙醛，有效提高了方法的准确性。通过碱水解分析葡萄酒中乙醛含量存在很多限制条件，比如在碱水解之后还需要酸化和衍生步骤，操作繁琐，通常需要长达30 h 的反应时间。因此，进一步改善分析方法尤为重要。为简化样品制备程序，Han 等采用酸水解替代碱水解，将反应温度提高到65 ℃以减少反应时间，同时使用过量抗氧化剂二氧化硫来清除过氧化氢并逆转醌的生成，防止通过芬顿反应产生羟基自由基，准确地检测出不同年龄和品种的葡萄酒中乙醛含量。亚硫酸氢盐加合物用酸进行水解，取代标准的碱性水解，省去了水解和衍生化同时进行的步骤，操作更简单，反应时间更短，制备的样品在室温下具有合适的稳定性。

2.2 气相色谱法

气相色谱分析对于葡萄酒质量控制和理解其感官特性是非常重要的工具，因其良好的灵敏度和较短的分析时间被广泛用于醛类的分析。为了获取更全面的物质信息，气相色谱-质谱联用检测器广泛应用于挥发性化合物的研究。该方法首先将样品引入气相色谱仪蒸发挥发性成分，通过流动相使蒸汽通过色谱柱。但非挥发性基质仍然存在于注入器中，污染注入器，这种类型的样品显然不能引入仪器，因此，提取挥发性成分是一个必不可少的环节。

葡萄酒乙醛的提取通常采用液-液萃取、固相微萃取等方法。液液萃取法是葡萄酒中提取挥发性成分的参考技术，可以识别葡萄酒中的痕量化合物，主要缺点是对挥发性强的物质萃取较差，在某些情况下涉及一些成分的损失或降解，或形成一些不在原始葡萄酒中存在的化合物。固相微萃取法是一种成熟的技术，将采样、萃取、浓缩和样品引入气相色谱注射器集中在一个无溶剂步骤中，可以采用顶空模式。顶空是一种快速、简单、环保的采样方法，用于分析食品中的挥发性组分，在静态顶空气相色谱中，样品与顶空之间达到平衡，提取该顶空气相的一部分用于气相分析，由于样品制备和提取方法简单，适用于葡萄酒中大部分挥发性化合物的常规分析和定量。Ubeda 等通过静态顶空采样并优化了注入条件，成功检测出乙醛等挥发性化合物。与液-液萃取相比，该方法的优点是从样品基质中提取分析物，不使用有机溶剂，在色谱图中不出现溶剂峰，但此方法的灵敏度相对较低。

韦晓群等为了排除样品中基质的干扰，采用衍生化法提取游离态和结合态乙醛，利用气相色谱-质谱更好地解决了乙醛总量测定和基质干扰的问题，缺点是操作略繁琐；Aguera 等建立了一个预测乙醛气体-液体比的分配模型，利用气相色谱法测定乙醛在气相中的浓度，根据预测乙醛的模型估算液相中游离乙醛含量，同时，对液相进行取样，通过酶促法进行测量，从而测定液相中的总乙醛含量；Cecchin 等使用全二维气相色谱分析进行定量，使乙醛分离仅在第二个色谱图维度内进行，有效测定了乙醛和其他羰基类化合物。

2.3 酶法检测

葡萄酒中乙醛的含量可以应用酶法进行检测，酶促法基于以下反应：

其中ALDH 是乙醛脱氢酶，NADH 的生成量与乙醛的量呈化学计量关系，可通过其在340 nm 处的吸光度来确定，酶法的一个缺点是在测定前需要脱色或脱气。NADH 的测定可采用高电位化学监测法，然而在高电位下会导致其他化合物被氧化，为解决此问题，可以采用六氰铁酸盐作为介质来测定NADH。Noguer 等通过利用六氰铁酸盐酶在低电位进行电化学氧化NADH，从而得到乙醛含量，该方法快速、准确，使用方便，然而此方法检测乙醛具有检测限较低，脱色成本高昂等缺点；Iitani等构建了两种不同的光纤生物传感器，分别使用乙醛脱氢酶或乙醇脱氢酶测量液相中的乙醛，通过各自酶的催化反应产生或消耗的NADH 来检测乙醛的浓度，在乙醛测量系统中，将紫外发光二极管和光电倍增管连接到分叉光纤上，用于激发和检测NADH，与乙醛脱氢酶介导的乙醛生物传感器相比，乙醇脱氢酶介导的乙醛生物传感器具有更高的灵敏度、更宽的动态范围和快速测量能力，并成功检测出9种不同的葡萄酒样品中的乙醛；Ghica等利用两种不同的固定化技术（溶胶-凝胶捕获或戊二醛交联）制备了乙醛的双酶生物传感器，用于葡萄酒样品中乙醛的测定。酶法检测乙醛具有快速、准确、方便等优点，然而在以上方法中，并未对总乙醛或自由态乙醛的检测做出区分。

2.4 电泳法

毛细管电泳以其快速、高效、重现性好、样品体积少、溶剂消耗少以及易于清除污染物等优点，被认为是一种重要的分析分离技术。通过使用紫外-可见分光光度法和电导检测，对空气样品中醛类化合物进行毛细管电泳分离，取得了良好的结果。微型设备（微芯片）因其高效分离、试剂消耗量小和尺寸小等显著优势，取得了良好发展。毛细管电泳与电化学检测相结合，具有高灵敏度、可选择性以及与微加工技术相兼容等优点，为便携式毛细管电泳系统提供了许多理想的功能，然而此方法并未针对总乙醛或自由态乙醛的检测做出研究。Dossi 的团队已应用微芯片电泳耦合毛细管电泳测定空气和植物油样品中的轻醛。微芯片制造工艺成本高、耗时长，需要将电极与通道出口进行高技能的微对准，是对日常重复性的一个考验。因此，Zhang等改进了一种新型微型毛细管电泳电化学检测系统，选择2-硫代巴比妥酸(TBA)作为电活性物质，乙醛-TBA 加合物具有电活性的性质，从而便于乙醛的检测，该系统具有可靠性高、成本低、操作简单、无需微细加工等优点。

综上所述，乙醛的检测方法主要包括气相色谱法、液相色谱法、酶法、电泳法，随着研究的深入，乙醛的检测方法也在不断进步。液相色谱法灵敏度高、分离度好、结果准确，缺点是仪器较昂贵；气相色谱法具有简单、灵敏度高和分析时间短等优点，但是分析成本较高；酶法具有快速、准确、使用方便等优点，但测定前需要脱色或脱气；电泳法具有高效、样品体积少、溶剂消耗少等优点，然而检测成本较高。不同检测方法各有其优缺点，应根据实际应用的情况而择其适合的方法。

3 展望

乙醛含量不但直接决定干红葡萄酒的风味质量，而且在干红葡萄酒陈酿过程的化学演变中也起着十分重要的作用。通过酿酒工艺的优化精确调控乙醛水平是干红葡萄酒生产需要重点关注的问题。目前乙醛的检测方法较复杂，尤其是游离态乙醛和总乙醛的检测。在今后的研究中，可以进一步优化结合态乙醛的裂解方法，降低分析成本，缩短分析时间，对精确监控葡萄酒实际生产中的乙醛水平具有重要的意义。