PI3K/Akt 信号通路相关蛋白在胃癌细胞中的表达及其意义

周小双 赖斌

1.上饶市人民医院普外科，江西上饶 334000；2.南昌大学第二附属医院胃肠外科，江西南昌 330006

在中国，胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，近年来，由于针对胃癌相关筛查工作的开展、人们体检意识的增强及相关危险因素的控制，胃癌整体发生率和病死率有一定程度的下降，但我国人口基数庞大，胃癌疾病负担依然十分严重。胃癌是来源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，是胃部最常见的恶性肿瘤之一。研究表明肿瘤的形成是细胞生长、增生调控发生紊乱的结果，针对信号通路参与调控细胞生长与增生在肿瘤发生、发展过程中的作用是当下研究的热点之一。安俊平等研究发现，磷脂酰肌醇3 激酶（phosphoinositide 3–kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）信号通路的激活可促进胃癌细胞增生、抑制凋亡、促进肿瘤细胞向DNA合成期及有丝分裂期转化，在胃癌的发生、发展过程中起着至关重要的作用。目前以PI3K/Akt 信号通路关键分子为靶点的肿瘤靶向治疗正在蓬勃发展。本实验通过免疫荧光法探讨PI3K/Akt 信号通路相关蛋白磷酸化PI3K（phosphorylated phosphoinositide 3–kinase，p–PI3K）、磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，p–Akt）在胃癌细胞及正常细胞中表达的差异，分析PI3K/Akt 信号通路在胃癌发生与发展中的作用，旨在为胃癌的早期诊断、预防和治疗提供新的方向。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2017 年1 月至2018 年12 月南昌大学第二附属医院经胃镜病理确诊为胃癌并行手术切除患者的胃癌标本100 例，同时取对应癌旁组织（距离肿瘤切缘5cm）共计100 例，所有患者既往均无放、化疗及腹部手术史；术后病理明确诊断为胃癌。其中男61 例，女39 例；年龄35～78 岁，中位年龄63岁；根据最新版胃癌TNM 分期标准：Ⅰ期9 例，Ⅱ期33 例，Ⅲ期51 例，Ⅳ期7 例；分化程度：低分化41 例，中分化46 例，高分化13 例；浸润深度：病灶穿透浆膜63 例，未穿透37 例；淋巴结转移：发生淋巴结转移72 例，无淋巴结转移28 例。同时取48 例胃镜检查正常者的胃黏膜组织，其中男26例，女22 例，年龄31～68 岁，中位年龄58 岁。胃癌患者与检查正常者的年龄和性别比较差异均无统计学意义（>0.05）。本研究经南昌大学第二附属医院伦理委员会批准（伦理审批号：研临审2018 第105号），全部患者均签署知情同意书。

1.2 主要方法与试剂

所有标本离体后进行甲醛固定并石蜡包埋，4μm连续切片，用免疫组织化学SP 法检测p–PI3K、p–Akt在胃癌组织、癌旁组织及正常胃黏膜组织中的表达情况。兔抗人p–PI3K 购自北京博奥森生物技术有限公司；兔抗人p–Akt、DAB 显色剂及免疫组织化学SP 试剂盒购自中国武汉赛维尔生物科技有限公司。

1.3 结果判读

试验采取双盲法，由两位试验参与者对染色结果进行判读，以视野中组织细胞的细胞质及细胞核出现棕黄色颗粒为阳性表达，p–PI3K 表达于细胞质，p–Akt 主要表达于细胞质，部分表达于细胞核，根据染色程度分为无染色、浅黄色、棕黄色、黄褐色，分别代表0～3 分，得分计为a。根据视野内阳性细胞所占比例分为≤10%、>10%～25%、>25%～50%、>50%，分别代表0～3 分，得分计为b。最终评分=a×b，取两位试验人员评分的平均值为最终评分，最终评分≥3 分为阳性，<3 分为阴性。

1.4 统计学方法

采用SPSS 16.0 统计学软件对数据进行处理分析。收集PI3K/Akt 信号通路中相关蛋白p–PI3K 和p–Akt 在胃癌组织、癌旁组织和正常胃黏膜中表达的相关数据，采用检验进行统计分析，以<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 p-PI3K、p-Akt 在胃癌组织、癌旁组织及正常胃黏膜中的表达差异

试验结果显示，p–PI3K、p–Akt 阳性表达的细胞质中出现明显黄色、棕黄色颗粒，p–PI3K 在胃癌组织、癌旁组织及正常胃黏膜中的阳性表达率分别为55.0%、23.0%及14.6%；p–Akt 在胃癌组织、癌旁组织及正常胃黏膜中的阳性率分别为29.0%、13.0%及8.3%，胃癌组织中p–PI3K、p–Akt 的表达率显著高于癌旁组织及正常胃黏膜（<0.05），见图1、表1。

表1 胃癌组织、癌旁组织、正常胃黏膜中p-PI3K、p-Akt 的表达差异（例）

图1 胃癌组织、癌旁组织及正常胃黏膜细胞的p-PI3K、p-Akt 的表达差异（SP 法染色）

2.2 p-PI3K、p-Akt 的表达与胃癌相关病理参数之间的关系

试验结果显示，胃癌组织中p–PI3K、p–Akt 的表达与患者的年龄、性别无明显相关性（>0.05），肿瘤病理分期Ⅲ～Ⅳ期、低分化、浸润深度穿透浆膜及淋巴结转移的患者胃癌组织中p–PI3K、p–Akt的阳性率更高（<0.05），见表2。

表2 p-PI3K、p-Akt 的表达与胃癌相关病理参数之间的关系（例）

3 讨论

肿瘤的形成是基于细胞增生、分化失控的复杂过程，本研究中的PI3K/Akt 信号通路作为细胞中重要的信号通路之一，可通过激活众多下游效应分子，从而抑制细胞凋亡、促进细胞增生、加速肿瘤细胞侵袭及转移，与肿瘤的发生、发展及预后密切相关。本研究发现，p–PI3K 在3 种组织细胞中的阳性率分别为55.0%、23.0%、14.6%；p–Akt 在3 种组织细胞中的阳性率分别为29.0%、13.0%、8.3%，两种蛋白在胃癌组织、癌旁组织及正常胃黏膜组织中的表达阳性率均呈逐渐下降趋势，差异均有统计学意义；同时通过比较不同临床病理参数下胃癌组织细胞内的p–PI3K、p–Akt 表达阳性率后发现，不同年龄、性别的患者，其胃癌组织中的p–PI3K、p–Akt 表达差异无统计学意义；但在肿瘤不同分化程度、浸润深度、病理分期、淋巴结转移的基础下，两种蛋白质的表达率差异均有统计学意义，且从各项指标综合分析可以看出，分化程度越低、浸润深度越深、病理分期越晚、存在淋巴结转移的患者两种蛋白的表达阳性率更高。

综合分析可以得出，PI3K/Akt 信号通路在胃黏膜细胞癌变过程中出现过度激活，激活后的信号通路在胃癌细胞的增殖、侵袭和转移过程中起着积极作用。通过参与调控细胞周期促进肿瘤的发生，PI3K/Akt 信号通路活化后可激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）；mTOR 促进细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin–dependent protein kinase，CDK）与细胞周期蛋白结合，CDK 的活化可使细胞周期启动，促进细胞周期由G期转换到S 期，缩短细胞周期，从而促进肿瘤的发生、发展。PI3K/Akt 通路活化后促进凋亡蛋白与伴侣蛋白结合，从而抑制凋亡复合体的形成，进而抑制肿瘤细胞凋亡；同时PI3K/Akt 通路活化后通过抑制含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）家族中的caspase–9 的磷酸化而使之失活，进一步抑制线粒体释放抑制细胞色素C 等凋亡因子，抑制凋亡。PI3K/Akt 通路的激活可通过激活血管内皮上的内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS），从而在血管内生成一氧化氮，协助调节血管功能，引起血管扩张、血管重塑及血管的新生；同时上调血管表皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和其他血管生成因子，从而促进肿瘤血管的生长。PI3K/Akt 通路激活后可激活基质金属蛋白酶（matrix metalloprpteinase，MMP），MMP 是一种锌离子依赖的蛋白水解酶超家族。在人体中，活化的MMP 几乎可水解所有的细胞外基质，肿瘤细胞周围的细胞外基质水解后，使肿瘤细胞更易脱离瘤体，从而转移到人体其他部位，进而使肿瘤的侵袭与转移加速。淋巴结转移是胃癌转移的重要途径，相关研究证实PI3K/Akt 信号通路活化后不仅可促进肿瘤生长，同样可促进肿瘤微淋巴管的形成。Liu等研究发现PI3K/Akt 通路的活化确实可促进胃癌细胞的淋巴结转移，究其原因可能是活化的PI3K/Akt 通路使胃癌组织内的微淋巴管密度增加，从而增加肿瘤细胞与淋巴系统的接触面积，加速肿瘤细胞经淋巴系统扩散。

随着研究的深入，研究者发现PI3K/Akt 信号通路的激活除了在肿瘤发生及发展过程中起着重要作用外，在肿瘤的耐药性进程中也扮演着重要角色。研究证实在胃癌、乳腺癌及白血病等肿瘤中，PI3K/Akt 信号通路在化疗耐药的形成与维持中起着重要作用。另外，研究发现使用PI3K 抑制剂处理后的胃癌耐药细胞对顺铂的敏感度增加，在黑色素瘤的研究中也发现PI3K 抑制剂可逆转胰岛素所引起的化疗耐药；而阻断PI3K/Akt 信号通路可逆转其耐药，恢复肿瘤细胞对化疗药物的敏感度。

综上所述，PI3K/Akt 信号通路中相关蛋白p–PI3K 和p–Akt 在胃癌组织中的表达明显高于正常组织，同时随着患者胃癌病情的进展，两种蛋白的表达阳性率也逐渐升高，因此，针对PI3K/Akt 通路的相关检测及靶向药物的应用可作为临床诊断及治疗胃癌的一个新策略。