玫瑰香葡萄伤流液生理活性物质非靶代谢组学分析

刘梦迪，朱欢，谢兆森，凌裕平

（扬州大学，江苏扬州 225000）

葡萄伤流液（Bleeding）是指在冬末春初时从葡萄枝条伤口流出的汁液，包含根部从土壤中吸收的水、矿质元素，根系合成的生物体需要的糖类、蛋白质、氨基酸、植物激素等丰富的化学成分[1-2]，其中含有部分植物组织液、细胞液及韧皮部有机物等。葡萄伤流液含有丰富资源，生产上有将伤流液应用于葡萄膨大保果的报道，也有将葡萄伤流液应用于保健的报告[3]，但未全面揭示伤流液整体生理活性物质组成。

葡萄萌发前的一个重要时期即伤流期，葡萄在这期间从休眠状态向活跃生长期过渡，根压通常被认为是导致伤流产生的原因，根系生理活动导致的水势差使得伤流产生。近年来，国外重新关注伤流的产生与根压的关系[4]，相关研究通过断层扫描技术和三维重建分析产生“根压”的木质部导管形态。目前，国内伤流液研究主要集中于伤流液成分药用价值方向，对伤流液的基本生理活性成分研究还处于基础阶段[5]。本研究通过非靶向代谢组学手段测定葡萄伤流物质含量，非靶向代谢组学相较普通代谢组学分析更为全面，详尽检测存在的代谢物，从而尽可能多地体现葡萄伤流液总体代谢物信息[6]。

1 试验目的

通过测定代谢组产物，旨在为学术研究伤流液的产生、参与代谢机理、参与生理活动及为相关生产应用（如调节生长过程）、活性成分应用（内源激素）、药用保健成分生产应用提供科学的依据。

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 试验样品。在伤流产生中期，用离心管采集5 棵生长状况一致的玫瑰香（位于江苏扬州邵伯湖度假村果园，日光温室4 年生限根栽培种植，采用“H”形整枝，株行距规格8m×10m）1 年生枝条流出的伤流液。收集后，立即置于放有干冰的泡沫盒中暂存，尽快送回试验室，液氮冷冻后，立即放置于-80℃超低温冰箱保存。

2.1.2 主要试剂。甲醇（Thermo，≥99.0%）、2-氯苯丙氨酸（Aladdin，98.5%）。

2.1.3 主要仪器。液相色谱仪（Thermo U3000）、质谱仪（Thermo QE Focus）、真空浓缩仪（eppendorf 5305）。

2.2 方法

2.2.1 代谢物提取。融化样本，置于4℃条件下，2mL 离心管里加入100μL 样本、400μL 甲醇（-20℃），通过60s 振荡，使得样本和甲醇溶液混合均匀。4℃条件下离心10min（12000rpm），将所有上清液吸取至新的2mL离心管，真空浓缩干燥，加入150μL2-氯苯丙氨酸（4ppm）80%甲醇溶液复溶，0.22μm 膜过滤上清液，得到待测样本，重复5 次。

2.2.2 非靶代谢组测定。由苏州帕诺米克生物医药科技有限公司检测。（1）色谱条件。采用ACQUITY UPLC@HSS T3 1.8 μm（2.1mm×150mm）色谱柱，自动进样器温度8℃，流速0.25mL/min，柱温40℃，进样2μL 梯度洗脱，流动相为正离子0.1%甲酸水（C）-0.1%甲酸乙腈（D）；负离子5mM 甲酸铵水（A）-乙腈（B）。梯度洗脱程序为0～1min，2% B/D；1～9min，2%～50% B/D；9～12min，50%～98% B/D；12～13.5min，98% B/D；13.5～14min，98%～2%B/D；14～20min，2%D-正模式（14～17min，2%B-负模式）。（2）质谱条件。电喷雾离子源（ESI），正负离子电离模式，正离子喷雾电压为3.50kV，负离子喷雾电压为2.50 kV，鞘气30arb，辅助气10arb。毛细管温度325℃，全扫描分辨率70000，扫描范围81～1000，并采用HCD 进行二级裂解，碰撞电压为30 eV。

2.2.3 物质鉴定。先确认代谢物精确分子量（误差≤30mg/mL），后根据MS/MS 碎片模式确认注释获得代谢物。

3 结果与分析

3.1 玫瑰香葡萄伤流液主要代谢物（见表1）

表1 玫瑰香葡萄伤流液主要代谢物

3.2 玫瑰香葡萄伤流液代谢物涉及的代谢通路

由图1 可知，玫瑰香葡萄伤流液中148 个代谢物定位到34 条通路上，75 个代谢物未能找到相应的代谢通路。以三羧酸循环为骨架，涉及的代谢通路有：醣酵解/糖异生、抗坏血酸和苦杏仁代谢、戊糖和葡萄糖醛酸盐互变、果糖和甘露糖代谢、酪氨酸代谢、嘧啶代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、丙氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、类黄酮生物合成、苯丙氨酸代谢、色氨酸代谢、烟酸和烟酰胺代谢等。较多物质在戊糖和葡萄糖醛酸盐的相互转化，酪氨酸代谢、果糖与甘露糖代谢3 条代谢通路上检测到，还有一些代谢物，如2-丁酮酸、木质酸等参与多条代谢。

图1 玫瑰香葡萄伤流液简化代谢通路网络

4 讨论

在内外因素作用下，植物最终通过基因转录和蛋白质表达形成代谢产物，这是生物表型的物质基础。同时，代谢物可以对基因转录、蛋白质表达和活性产生反作用。作为一类固着性生物，植物可产生总数在20 万～100 万种的代谢产物[7]。经非靶代谢检测发现，玫瑰香葡萄伤流液的代谢物主要由三部分组成，即初生代谢物、次生代谢物和其他非植物有机体。

（1）伤流液中初生代谢物主要为糖类、脂质、氨基酸类、核苷酸及三羧酸循环中间的有机酸等。构成蛋白的20 种氨基酸共检测出14 种，分别为天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、络氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸；核酸检测出包括胞嘧啶核苷和鸟嘌呤核苷两种脱氧核糖核酸、尿嘧啶核苷一种核糖核酸；有机酸包括三羧酸循环中的系列——柠檬酸、酮戊二酸、草酸、延胡索酸、苹果酸，无氧呼吸产生的乳酸，合成芳香族氨基酸和其他多种芳香族化合物的起始物质莽草酸及糖酵解产物丙酮酸等。通过KEGG 查找初生代谢物的分布情况，发现集中于糖类、多种氨基酸和核酸代谢途径，初生代谢物是生长发育及后续生理活动所必须的。玫瑰香葡萄伤流液检测结果能一定程度反应葡萄伤流期间树体生理活动和为发芽做的准备，糖类、氨基酸和脂质等初生代谢物积累和活跃，这些大多来自根系，表明发育开始之前，根系为供应地上部分所需的含氮化合物与碳水化物已进行许多转化和合成作用的代谢活动。尿嘧啶核苷的检出从侧面反映伤流液中存在与RNA 相关的核酸生理活动，这与郑婷等[8]研究结果一致，木质部树液在伤流期间承担着传递遗传信息的功能。

（2）葡萄伤流液中种类最丰富的是次生代谢物，通过KEGG 定位次生代谢物所在通路，发现主要来源于各种氨基酸代谢转化，而次生代谢物主要参与植物的信号传导、植物与环境的互作及植物防御等[9]。伤流液次生代谢物按照生物合成的起始分子和功能，包含维生素、生长类物质、苯丙烷类、有机酸和生物碱等，这些物质之前较少有文献报道。检测出的生物碱有甜菜碱、胆碱和烟碱，甜菜碱是由胆碱和甘氨酸合成，是植物体内调节细胞内渗透压的重要缓冲物质，在逆境中具有保护细胞膜的功能；γ-氨基丁酸（GABA）由谷氨酸脱羧酶催化形成，能通过调控植物的抗氧化防御系统来缓解逆境胁迫；生长类物质包括生长素、油菜素内酯、儿茶酚胺和水杨酸等，这些物质均能提高植物逆境抗性。另外，苯丙烷代谢物质对于果实成熟至关重要，能够调控多项关于葡萄转色基因；尸胺、亚精胺、腐胺等多胺参与植物体内DNA 和蛋白质的生物合成及RNA 翻译；吲哚乙酸、吲哚乙腈等生长素已证实，在西瓜膨大方面发挥着一定作用。这些植物激素对果实的发育和膨大均能起到积极作用，一定程度解释了用伤流液来代替人工激素处理果实，可以使其膨大的原理，这项技术的应用相较于传统的激素喷施更绿色、环保，也能减少植物伤流期的营养浪费。

（3）玫瑰香伤流液中其他非植物有机体的成分，如二甲基砜、三氟醋酸，来自自然土壤与地下水，进一步表明伤流与根系吸收的木质部径流有关。

（4）玫瑰香葡萄伤流液中的一些物质目前已证实有一定药用价值，如烟酰胺核苷酸广泛参与人体多项生化反应，与免疫、代谢息息相关，能够延缓、改善、防止衰老；甘草查耳酮A 具有抗炎、抗肿瘤、抗微生物、抗HIV、抗过敏等多种作用[10]；肌醇可帮助降低胆固醇，促进细胞新陈代谢[11]。

5 结论

通过对玫瑰香葡萄伤流液进行非靶代谢鉴定，发现其含有丰富的初生代谢物、次生代谢物、其他非植物有机体。在前人研究发现的基础上，检测出之前没有报道过的新物质。通过KEGG 查找代谢物的分布情况，发现初生代谢物集中在糖类、多种氨基酸和核酸代谢途径，次生代谢物主要来源于各种氨基酸代谢转化。分析这些物质的来源和功能推测，伤流液不仅承担着运输养分和遗传信息的功能，而且要抵御逆境胁迫带来的威胁。

伤流在以往的文献报道中，已展现出较强的抗羟自由基能力和热稳定性[12]。本研究在此基础上，进一步加深对伤流液成分的探究，分析葡萄伤流中的活性物质与经济物质，既能为研究葡萄伤流和伤流期后期的萌芽机理提供基础数据，又能为生产上伤流液运用于果实品质的提升机理进行研究。同时发现伤流液中的一些物质具有保健和美容功效，可为将来葡萄伤流液的保健品开发提供新思路。