MiR-let-7g-3p靶向HMGB2调控膀胱癌细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡

膀胱癌是目前最常见的9大癌症之一，在所有新诊断的病例中，75%表现为非肌肉浸润性膀胱癌（NMIBC），25%表现为肌肉浸润性膀胱癌（MIBC），并且在所有实体癌中，膀胱癌的复发率最高。经一线治疗后，50%～70%的NMIBC患者会在5年内复发，10%～30%的患者将进展为MIBC。可见，如何降低膀胱癌复发率，改善患者生存预后是膀胱癌领域的重要问题。

微小核糖核酸（miRNAs）是一种小的非编码核糖核酸，由19～25 个核苷酸组成。目前，已有多种miRNAs 在癌症中被证明是促癌基因（如miR-92 和miR-194）或抑癌基因（如miR-199b和miR-99a）。然而在膀胱癌中，还有许多下调miRNAs尚未得到充分的研究，其功能和靶基因有待进一步阐明。let-7g-3p是定位于3 号染色体上属于let-7 基因家族编码的一种miRNAs，let-7家族编码的miRNAs已被证实能够通过负性调控ras表达来发挥致癌作用。let-7g-3p参与多种人类代谢性疾病，例如阿尔茨海默症、肿瘤以及Graves病等。在肿瘤研究方面，研究发现let-7g-3p参与细胞外基质中受体的相互作用并且与癌症中的蛋白多糖的合成有关，该机制与小儿星形细胞瘤的发生发展有关。但目前尚未有研究报道let-7g-3p对膀胱癌生物学行为的影响并且其下游的相关信号因子和潜在机制仍然未知。

因此本研究将let-7g-3p作为研究对象，通过多种实验方法，旨在明确let-7g-3p靶向HMGB2抑制膀胱癌的作用和分子机制，为临床治疗膀胱癌提供潜在的治疗靶点和理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料及试剂

正常人尿路上皮细胞系SV-HUC-1，以及膀胱癌细胞系T24、5637 和EJ（中国科学院上海细胞库）；RPMI 1640培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素双抗和胰酶（Gibco）；脂质体转染试剂Lipo2000、TRIzol、PowerUp SYBR Green Master MIX PCR试剂盒和山羊抗兔二抗（Thermo Fish）；逆转录试剂盒（Takara）；mimics-NC、let-7g-3p mimics、Inhibitor-NC、let-7g-3p inhibitor、si-NC以及si-HMGB2均由上海吉玛公司设计并合成；HMGB2抗体（Abcam）。

1.2 组织样本

所有组织样本均来源于在蚌埠医学院第一附属医院纳入治疗的BLCA患者，患者他们均未在术前接受放疗或术前化疗。所有标本均按医学伦理规范进行处理。

1.3 细胞培养及转染

加蓬奥果韦河特大桥预应力混凝土箱梁菱形挂篮施工分析…………………………………………… 曾进虎，尹良帅（3-119）

1.4 CCK8细胞增殖实验

将转染后的T24细胞接种于96孔板中，分别培养24、48、72 h后，每孔加入10 μL CCK8溶液，避光，37 ℃条件下孵育1 h，酶标仪检测细胞在450 nm处的吸光度值，实验重复3次。

1.5 Transwell 小室法

收集转染后的细胞，细胞侵袭实验中，上室面制备Matrigel胶后，将细胞用无血清培养基调整为2×10/mL，吸取100 μL加入上室。下室加入含20%胎牛血清的1640 培养基。37 ℃恒温培养箱中培养24 h 后，轻轻去除上室中的细胞和Matrigel 胶，4%多聚甲醛固定30 min后结晶紫染色，显微镜下拍照并分析。细胞迁移实验中，Transwell上室不加入Matrigel胶，其余步骤同细胞侵袭实验，实验重复3次。

1.6 流式细胞术

为确定let-7g-3p下游靶基因的生物学功能和重要通路，对测序结果中的1597个差异表达基因进行了GO和KEGG通路富集分析，结果显示这些差异表达基因参与了与细胞进程等相关的途径（图10A），此外，KEGG富集分析显示这些差异表达基因与癌症中的蛋白多糖、细胞凋亡以及一些致癌途径如P53和TNF信号通路有关（图10B）。

正常人尿路上皮细胞系HUC，以及膀胱癌细胞系T24、5637及EJ细胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养。培养箱条件37 ℃、5%CO。当细胞融合度在80%左右时0.25%胰酶消化传代，每2 d换液或传代1次。在其生长状态良好时，将T24细胞接种于6孔板中，生长至60%融合度，按照Lipofectamine 2000 试剂说明书，将miR-NC、let-7g-3p-mimics、let-7g-3p-inhibitor、si-NC以及si-HMGB2、转染入细胞（序列见表1）。

1.7 RNA的提取及实时荧光定量PCR

提升广西中央预算内投资执行绩效的思考 …………………………………………………………………………… 梁安柱（2/06）

1.8 转录组测序分析

收集转染mimics-NC和let-7g-3p-mimics后的T24细胞，每组各3个样本，采用TRIzol试剂提取总RNA，Nanodrop分光光度计（ND-ONE-W）检测RNA样品的纯度、浓度和完整性，进行文库构建，加入Fragmentation Buffer 将mRNA 进行随机打断，以mRNA为模板，用六碱基随机引物合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H 和DNA polymerase I合成第二条cDNA链，利用AMPure XP磁珠纯化cDNA，纯化的双链cDNA再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后用AMPure XP磁珠进行片段大小选择，最后通过PCR富集得到cDNA文库。文库构建完成后，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度（文库有效浓度＞2 nmol/L）进行准确定量，以保证文库质量。库检合格后，不同文库按照目标下机数据量进行混合，用Illumina平台进行测序。

1.9 Western blot

收集细胞后使用冷PBS洗涤两次，RIPA细胞裂解液冰上裂解30 min，将裂解物以4 ℃，12 000 r/min离心15 min，使用BCA蛋白定量试剂盒测定上清液中的蛋白质浓度。在SDS-PAGE上加入等量的蛋白质样品并转移到PVDF 膜上，随后使用5%脱脂奶粉封闭1 h，4 ℃孵育一抗摇床过夜。第2天二抗室温孵育1 h，TBST洗3 次，使用化学发光试剂观察蛋白质条带并使用Image J进行分析。

同志们，水利事业正处于新的发展阶段，规划计划部门任务繁重，责任重大，使命光荣。让我们在以胡锦涛同志为总书记的党中央领导下，深入贯彻落实科学发展观，全面落实中央的各项部署，加大工作力度，锐意改革进取，扎实做好工作，努力开创水利规划计划工作新局面，为实现水利更好更快发展作出新的更大贡献，以优异成绩迎接党的十八大胜利召开！

1.10 双荧光素酶报告实验

构建HMGB2野生型及突变型质粒，将细胞接种于6孔板中，分别或同时转染HMGB2野生型质粒、HMGB2突变型质粒、mimics-NC和let-7g-3p mimics，用双荧光素酶报告基因试剂盒检测各组荧光素酶活性。

1.11 统计学处理

采用SPSS 22.0统计软件和GraphPad Prism9进行数据分析处理。计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用检验，以＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 let-7g-3p在膀胱癌中的表达水平

与癌旁组织相比，膀胱癌组织中let-7g-3p的表达水平下降，差异有统计学意义（＜0.01，图1）。

CCK8 增殖实验显示，与mimics-NC 组相比，let-7g-3p mimics组的T24细胞的增殖能力明显减弱（＜0.01，图4A）；Transwell迁移和侵袭实验显示，细胞的迁移和侵袭能力均减弱（＜0.01，图4B、C）；流式细胞术分析显示，let-7g-3p mimics组的T24细胞凋亡增加（＜0.01，图4D）。反之，与inhibitor-NC组相比，let-7g-3p inhibitor组的T24细胞的增殖、迁移和侵袭能力明显增强，且凋亡减少。

2.2 let-7g-3p和HMGB2转染效率的验证

将miR-NC、let-7g-3p-mimics、let-7g-3p-inhibitor、si-NC以及si-HMGB2、转染入膀胱癌细胞后，通过qRTPCR进行了转染效率的验证，结果显示T24细胞中let-7g-3p和HMGB2的表达水平被成功敲低和过表达，差异有统计学意义（＜0.01，图3）。

2.3 let-7g-3p对膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响

与正常尿路上皮细胞SV-HUC-1相比，膀胱癌细胞系T24、5637和EJ细胞中let-7g-3p的表达水平下降，差异有统计学意义（＜0.01，图2）。其中T24细胞的表达水平最低，且在膀胱癌细胞系中，T24侵袭性较强，因此后续选择T24细胞作为实验对象。

4.孵化器企业对政府的扶持政策的意见和建议。本调查问题，16家孵化器没有回答。9家孵化器分别建议：制定更多的优惠政策、加大扶持力度尤其是对初创小微企业的扶持力度、帮助孵化器形成产学研对接的产业链、继续对创新企业租金补贴、提供一站式服务的营商环境、完善生活配套、营造招商氛围等。

2.3 let-7g-3p和HMGB2的靶向关系

为寻找let-7g-3p下游的目的基因，我们对过表达let-7g-3p的T24细胞进行了转录组测序，同组样本的生物学重复相关性均在99%以上，经过测序质量控制，共得到73.38 Gb的总碱基数，结果显示let-7g-3p mimics组与mir-NC组相比共有1597个差异表达的基因，其中有718个上调基因和879个下调基因（图5A）。接着以let-7g-3p为结合靶点，从Targetscan，MiRDB和miRTabase这3个在线数据库中获取了let-7g-3p的下游目的基因并取交集，最终共有31个基因纳入考虑（图5B）。其中，HMGB2基因在测序结果中显示表达下调，并且在线数据库都表明let-7g-3p和HMGB2之间存在结合位点（图5C、D），因此，我们选择HMGB2作为let-7g-3p的下游靶标并进行了进一步的验证。

双荧光素酶报告实验的结果显示，在野生型HMGB2中，转染let-7g-3p mimics 的293T细胞的荧光素酶活性显著降低（＜0.01），同时在突变型HMGB2中，两者之间无明显差异（＞0.05，图6）。为明确let-7g-3p如何调控HMGB2，进一步进行qRT-PCR实验，结果显示，let-7g-3p mimics 组的HMGB2 的表达水平与mimics-NC组相比明显下调（＜0.001，图7A），Western blot 结果显示let-7g-3p 组的HMGB2 的蛋白水平与mimics-NC组相比下调（＜0.01，图7B、C）。而在过表达HMGB2后let-7g-3p的表达水平无明显变化（＞0.05，图7D）。

2.4 HMGB2在膀胱癌细胞中的表达水平

与正常尿路上皮细胞SV-HUC-1相比，膀胱癌细胞系T24、5637和EJ细胞中HMGB2的表达水平上调，差异有统计学意义（＜0.01，图8）。

传统的电子提花机控制转接口传送数据的方法有两种.最常见的适合小型提花机的一种方法是将每一纬的N个数据串行移位传送至电磁提花装置中，循环重复；另外一种方法是将每一纬的数据先分流到M个I/O接口板上，然后M个I/O接口板中的N/M个数据同时串行移位到每个电磁驱动板上，再循环重复[10].对于大针数的电子提花机，数据位有10 000多位，第一种方法完全采用串行移位传送，传输速度太慢，并且出错概率大；第二种方法虽然采用了数据分流，减少了串行移位的数据量，但是每一纬的数据都要先分流到M个I/O接口板上，消耗的时间多，对提高传输速度的效果不明显.

2.5 let-7g-3p靶向HMGB2对膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响

CCK8细胞增殖实验显示敲低HMGB2部分逆转了敲低let-7g-3p促进膀胱癌细胞增殖的作用（＜0.01，图9A）；Transwell迁移和侵袭实验显示，敲低HMGB2同样能够逆转敲低let-7g-3p 促进膀胱癌细胞迁移和侵袭的作用（＜0.01，图9B、C）；流式细胞术的结果显示，敲低HMGB2可以增加let-7g-3p抑制的细胞凋亡（＜0.01，图9D）。

2.6 let-7g-3p下游靶基因的GO和KEGG通路富集分析

收集转染后的细胞，取5～10万重悬的细胞，1000 g离心5 min，弃上清。195 μLAnnexin V-FITC结合液重悬细胞。加入5 μLAnnexin V-FITC，10 μL碘化丙啶染色液，混匀后室温孵育10～20 min，流式上机检测，实验重复3次。

根据说明书，使用Trizol试剂从组织和细胞中分离总RNA，反转录成互补脱氧核糖核酸（cDNA），PowerUp SYBR Green Master MIX PCR试剂盒用于测定let-7g-3p 的表达水平（U6 作为内参基因），SYBR Green Mix 用于测定HMGB2（GAPDH作为内参基因）的表达水平。95 ℃预变性1 min 后，95 ℃变性20 s，60 ℃退火20 s，共40个循环，2法用于计算目的基因的相对表达量。使用Primer 5.0设计引物（表2）。

3 讨论

本研究首次揭示了let-7g-3p在调节膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡中的功能作用及其下游的相关分子机制，通过qRT-PCR实验发现let-7g-3p在膀胱癌组织和细胞中的表达明显下调，之后在过表达let-7g-3p后显示膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力受到抑制同时凋亡增多，下调let-7g-3p后结果相反。以上结果表明let-7g-3p可以抑制膀胱癌细胞的生物学行为。在之前的研究中，circ_0001017能够通过靶向let-7g-3p抑制胶质瘤细胞增殖、EMT、迁移和侵袭，促进胶质瘤细胞凋亡，该结果证明在胶质瘤细胞中，let-7g-3p扮演着促癌因子的作用，这可能是由于let-7g-3p在不同肿瘤细胞中发挥相反的作用效果。

miRNA 通常靶向一个或多个mRNA，通过与下游的目的mRNA 特异性碱基配对引起mRNA的直接降解或翻译抑制，在转录后水平调控基因表达，从而调控细胞分化、生长、增殖、迁移和凋亡等。目前发现微小核糖核酸参与了哺乳动物基因组中超过50%的mRNA的调控。因此，为进一步探讨let-7g-3p的作用机制，我们对过表达let-7g-3p的膀胱癌细胞进行了转录组测序，发现HMGB2基因的表达量降低，并且在3个在线生物信息学分析的网站中，均表明HMGB2的3’UTR区存在let-7g-3p的碱基结合位点。同时，双荧光素酶报告实验验证了let-7g-3p和HMGB2的靶向关系。本研究qRT-PCR和Western blot进一步证实过表达let-7g-3p可以下调HMGB2的表达水平。基于以上结果，推测let-7g-3p通过负性调控HMGB2来抑制膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，并促进凋亡。HMGB2在膀胱癌细胞系中的表达水平均明显增高，在敲低HMGB2基因的膀胱癌细胞中，同时敲低let-7g-3p进行Rescue实验，实验结果表明过敲低HMGB2基因可以部分挽救敲低let-7g-3p对膀胱癌细胞生长的的促进作用。以上实验证明了let-7g-3p是通过负性调控HMGB2来抑制膀胱癌细胞的生物学行为。

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高迁移率族盒蛋白（HMGB）在建立活性或非活性染色质方面发挥着重要功能。哺乳动物HMGB 蛋白包含两个HMG 盒结构域和一个酸性C 末端。HMGB 蛋白可以进行翻译后修饰，以影响它们与DNA、蛋白质伴侣和细胞定位的相互作用。例如，HMGB1 可以进行乙酰化、磷酸化、甲基化、核糖基化和氧化，从而产生一系列复杂的潜在调控机制。有研究发现，HMGB2在肺腺癌组织中高表达，与肺腺癌患者的预后密切相关，该机制可能是由于HMGB2参与了细胞周期的调控使得细胞的增殖能力增强，并且在肝细胞癌、胰腺癌和皮肤癌等不同类型的人类癌症中均发现了HMGB2 的过表达。同时，有研究表明HMGB2的表达水平在膀胱癌患者中高度增加，并且HMGB2 的过表达与膀胱肿瘤的进展和血管生成显著相关，这与本研究结果相一致。

研究证实了let-7g-3p的过表达可以抑制膀胱癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力，并促进凋亡，但let-7g-3p在膀胱癌进展中的潜在机制仍未阐明。同时，过表达let-7g-3p组的膀胱癌细胞的增殖率明显低于对照组，且凋亡率明显高于对照组。因此，推断let-7g-3p主要通过抑制细胞增殖和促进细胞凋亡来干扰膀胱癌细胞的生长。通过对转录组测序的结果进行GO和KEGG富集分析，结果表明，let-7g-3p的下游靶基因参与了与细胞进程等相关的途径，并且主要富集于细胞凋亡以及P53、TNF等信号通路中。P53作为一种重要的转录因子，由位于人类17号染色体短臂（17p13.1）的TP53基因位点编码，在诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡中起到重要作用。目前，已有多种miRNA被证实通过靶向P53来影响肿瘤进展。一项关于体细胞DNA突变分析表明，近一半的高级别肌肉浸润性膀胱癌具有TP53突变，并且TP53功能在76%的患者中失活。因其在肿瘤细胞中有超过50%的突变率，通过诱导突变p53 降解，从而改善其促肿瘤功能已经肿瘤靶向治疗的一项新的策略。以上分析表明let-7g-3p可能主要通过靶向HMGB2/P53抑制细胞增殖并诱导细胞发生坏死性凋亡来抑制膀胱癌细胞的生物学行为，但这仍然需要进一步的实验验证。

式中：柴油机烟气的比热容通过经验公式计算得出［19］，ce1=0.808 kJ/（kg·℃），ρe1=0.627 kg/m3；ce2=0.762 kJ/（kg·℃），ρe2=0.892 kg/m3。

不久寒假终了，我就回到哈尔滨的学校念书去了。可是哥哥没有同来，因为他上半年生了点病，曾在医院里休养了一些时候，这次伯父主张他再请两个月的假，留在家里。

综上所述，本研究证实了MiRNA-let-7g-3p 靶向负性调控HMGB2抑制膀胱癌细胞的生物学行为，这可能为膀胱癌细胞的治疗和预后提供了新的靶点，有关let-7g-3p/HMGB2轴的下游机制仍需进一步研究。