MiR-125b-5p 抑制卵巢癌细胞的迁移和侵袭：基于靶向下调CD147的表达

卵巢癌是临床上较常见的女性生殖系统恶性肿瘤之一，其全球发病率仅次于宫颈癌和子宫体癌，而死亡率在女性生殖系统恶性肿瘤中居首位。尽管检测和治疗手段取得了进步，但在我国卵巢癌的发病率和死亡率仍相当高，并且逐年增加。卵巢癌患者早期症状不明显，缺乏有效的筛查和诊断方法，其中约70%患者发现时已是晚期，且可能也发生了转移和侵袭。因此探讨卵巢癌的发生发展机制，寻找新的卵巢癌生物标志物和潜在治疗靶标，是目前亟待解决的重大课题。

微小核糖核酸RNA（miRNA）是一类长度约为20-25个核苷酸的非编码小RNA分子，通过靶向mRNA进行切割或翻译抑制发挥重要的调控作用。其具有多种生物学效应，参与调控细胞增殖、分化、侵袭和凋亡等关键的细胞过。有研究表明一些miRNA在卵巢癌中异常表达，提示miRNA参与卵巢癌的发生发展过程。全基因组miRNA表达谱的研究发现miR-125b在人卵巢癌组织中异常表达。但miR-125b-5p在卵巢癌中的生物学功能及其调控的分子机制尚有待进一步明确。

miRNA 通过调控特定的靶基因发挥生物学功能。为确定miR-125b-5p在卵巢癌的调控机制，我们通过Starbase(http://starbase.sysu.edu.cn/)生信预测软件初步筛选出细胞外基质金属蛋白诱导因子（CD147），其为miR-125b-5p的假定靶点之一。CD147是一种单链跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族。前期本课题组以及其它研究均发现CD147在卵巢癌患者血清中高表达，与肿瘤的恶性进展呈正相关，能促进卵巢癌的侵袭转移。这提示CD147的高表达与卵巢癌的不良预后相关，且其可能在卵巢癌的早期诊断、预后评估、侵袭转移等方面具有重要作用。但miR-125b是否可通过靶向CD147来调控卵巢癌细胞的侵袭转移？这尚待进一步实验证实。

本研究通过收集临床卵巢癌与癌旁组织样本进行比较，并通过细胞转染、双荧光素酶报告基因实验、Transwell 实验等来考察miR-125b-5p 通过靶向调控CD147的表达来影响卵巢癌细胞的恶性生物学行为。本研究在临床样本及细胞水平层面展开，深入研究卵巢癌发生、发展的分子机制，为进一步理解卵巢癌的发生机制以及为卵巢癌的诊疗靶点选择提供新的理论依据。

1 材料和方法

1.1 临床样本

收集2019年1月～2021年5月于湖南省肿瘤医院行手术治疗并经病理学证实的50对卵巢癌组织及对应的癌旁组织（癌灶边缘≥3 cm）样本。所有患者术前均未接受任何放、化疗及免疫调剂治疗。所有标本均经病理医师确认。本研究获得本院伦理委员会审批，所有研究对象均签署知情同意书。术中获得标本后立即置于液氮中冻存。

1.2 细胞系及主要试剂

人正常卵巢细胞系NOEC细胞，购自中国医学院科学院细胞资源中心；卵巢癌细胞系SKOV3，HO8910、OVCAR3、A2780、OVCA429（ATCC）；HEK293 细胞（湖南优诚生物）；胰酶、抗生素（Invitrogen）；DMEM培养基，胎牛血清（GIBCO）；TRIzol RNA分离试剂（Taqman）；SYBR Green real-timePCR mixture（Qiagen）；限制性内切酶、dNTP、Taq酶以及快速连接试剂盒（TaKa-Ra）；CO恒温培养箱、实时荧光定量PCR（Thermo）；转染试剂脂质体Lipofectamine3000（Invitrogen）；荧光酶检测试剂盒（Promega）；pcDNA3.1质粒、pcDNA3.1空载体、miR-125b-5p mimic、mimic阴性对照序列（NC mimic）、miR-125b-5p inhibitor、inhibitor 阴性对照序列（NC inhibitor）和PCR引物，psiCHECK-2-CD147-WT及CD147-MUT双荧光素酶报告基因质粒（湖南丰晖生物）。

1.3 细胞培养及其转染

卵巢癌细胞株SKOV3、HO8910用含10%胎牛血清的DMEM 培养基，在37 ℃饱和湿度、含5%CO的恒温培养箱孵箱中培养。取处于对数生长期，生长状态良好的SKOV3，HO8910 细胞用0.25%胰酶消化后，通过细胞计数算后，按照密度为3×10/孔，种到6孔板中，铺细胞18～24 h，细胞长至60%～80%。使用Lipofectamine 3000将100 nmol/L miRNA模拟物或抑制剂（miR 125b 5p mimic，5' UCCCUGAGACCCU AACUUGUCA3'；miR 125b 5p inhibitor,UCACAAG UUAGGGUCUCAGGGA3'；mimic NC，5'UUCUCCG ACGUGUCACGUTT3'；and inhibitor NC，5'CAGU ACUUUUGUGUAGUACAA3'）、1 μg pcDNA3.1、pcDNA3.1-CD147转染到HEK293、SKOV3和HO8910细胞。转染48 h后收集细胞上清。

1.4 RT-qPCR检测癌细胞中miR-125b-p及CD147mRNA的表达水平

设计引物，所用引物序列及测序由优诚生物完成。然后取对数生长期卵巢癌细胞、卵巢癌组织样本，提取总RNA，逆转录为cDNA，聚合酶链式反应：阶段1（50 ℃，2 min）1个周期，阶段2（95 ℃，10 min）1个周期，阶段3（95 ℃，15 s，60 ℃，1 min）。最后进行数据分析，使用GraphPad Prism 4.0分析数据，所用引物序列见表1。

“今儿个呢，王爷？”晚饭毕，眼看着王爷已跨出饭馆门，戏班子几个人赶紧起身，用手胡乱抹几下嘴，追了出去。

1.5 Transwell实验

基质胶进行铺板，制作细胞悬液，使用胰蛋白酶消化贴壁细胞，PBS清洗后用无血清培养基重悬接种细胞，将细胞悬液加入Transwell小室，培养24 h固定，最后染色计数。

1.6 靶基因预测以及双荧光素酶报告基因实验

当细胞生长到对数期时，每组细胞用0.25%胰蛋白酶消化后，用移液管转移到10%胎牛血清培养基中备用。将细胞悬液按一定梯度稀释，在适当温度下接种于10 mL培养基中。梯度密度分别为50、100和200细胞/皿。将细胞置于37 ℃，5%CO，饱和湿度的培养箱中2周。在此期间，每天肉眼观察，直到培养皿中出现可见的克隆体，然后停止培养。弃去上清液，用PBS洗涤2次。然后加入5 mL 4%多聚甲醛固定细胞15 min。弃去固定液，最后加入适量的GIMSA染料溶液。最后，静置15 min，然后用纯净水洗掉。

1.7 Westem blot实验

通过Starbase在线数据库预测显示，miR-125b-5p与CD147具有潜在结合位点（图3A）。进一步通过双荧光素酶报告实验，结果表明在HEK 293细胞中，转染miR-125b-5p mimic和CD147 WT时，细胞的荧光素酶活性受到明显抑制（图3B）。

选择CD147表达最高的SKOV3细胞，miR-125b-5p表达最高的HO8910细胞这两种卵巢癌细胞系进行后续机制研究。在SKOV3 细胞中转染miR-125b-5p mimic 过表达miR-125b-5p，RT-qPCR 实验结果显示miR-125b-5p mimic组miR-125b-5p表达明显升高。而在HO8910 细胞中转染miR-125b-5p inhibitor 沉默miR-125b-5p，miR-125b-5p inhibitor 组细胞中miR-125b-5p的表达明显降低（＜0.01，图2A）。随后开展CCK8实验和细胞克隆形成实验，结果显示过表达miR-125b-5p组卵巢癌细胞的增殖速度明显下降（＜0.001，图2B、C）。通过Transwell实验表明过表达miR-125b-5p组穿膜细胞数要明显低于对照组（HO8910：＜0.001；SKOV3：0.001，图D）。

1.8 CCK-8检测

采用SPSS 23.0和GraphPad Prism 4.0统计分析。上述各项实验均重复3次。符合正态分布的计量资料数据用均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本检验，多组间比较采用方差分析和多重比较；两分类的计数资料间差异比较采用χ检验；利用Pearson 法检验miR-125b-5p和CD147 mRNA两者之间的相关性。＜0.05表示差异具有统计学意义。

1.9 细胞克隆实验

Starbase生信软件预测显示miR-125b-5p与CD147之间的潜在互补结合位点。取HEK293细胞，2×10/孔接种于96孔板，过夜后利用Lipofectamine3000将野生型（WT）及突变型（MUT）的CD147荧光素酶报告基因质粒及miR-125b-5p mimic与NC mimic质粒共转染入PC细胞中，每组设5个复孔继续培养，转染48 h后检测相对荧光素酶活性。

2.0 统计学处理

96空扳每孔接种100 μL细胞悬液，然后将培养板置于37 ℃，5%CO的培养箱中预培养24 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液，放置于培养箱中孵育4 h。最后用酶标仪测定吸光度。

2 结果

2.1 miR-125b-5p在卵巢癌组织及细胞系中均呈低表达，CD147呈高表达

RT-qPCR检测结果显示，与卵巢癌癌旁组织相比，50 例卵巢癌组织中miR-125b-5p 表达显著降低，而CD147 mRNA的表达显著增高（＜0.05，图1A、B）；另外，Pearson 相关性分析显示，在50 例卵巢癌组织中miR-125b-5p与CD147表达呈明显负相关（=-0.2961，＜0.01，图1C）。与人正常卵巢细胞系NOEC细胞相比，卵巢癌癌细胞系SKOV3，HO8910、OVCAR3、A2780和OVCA429细胞中CD147 mRNA表达均显著增加，而miR-125b-5p表达显著降低（＜0.05，图1D、E）。

2.2 过表达miR-125b-5p抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭

HPLC-双波长法同时测定苗药了哥王乙醇提取物中伞形花内酯和西瑞香素的含量 ……………………… 冯 果等（17）：2369

2.3 miR-125b-5p在卵巢癌细胞内靶向结合CD147

收集卵巢癌细胞、卵巢癌组织蛋白样品，取约20 mg加100 μL蛋白裂解液，匀浆器匀浆提取总蛋白，BCA 法蛋白定量，调节每份样品浓度，以20 μL/孔的蛋白量体积上样，样品加入1/5 体积的5×SDS 上样缓冲液，100 ℃煮沸5 min，进行SDS-PAGE 凝胶电泳。积层胶与分离胶的浓度分别为5%和10%。应用不连续缓冲系统进行垂直电泳，待溴酚兰指示剂达分离胶下部，断开电源。取下凝胶，用转移缓冲液浸泡数分钟，用蛋白湿转移装置将蛋白转移到PVDF 膜上，用鼠抗人P-gp，兔抗人E-cadherin,鼠抗人CD147和β-actin抗体37 ℃孵育1 h，4 ℃过夜，HRP 标记的二抗37 ℃孵育30 min，ECL 化学发光法显影定影，进行Western blot 分析。

卵巢癌是影响我国乃至全球女性生殖系统的主要恶性肿瘤之一。大多数卵巢癌患者确诊时已发展至晚期，使得手术完全切除困难，术后频繁复发，错过了最佳治疗时间。尽管近年来手术以及其他多种治疗方法都取得明显的进步，但是病人的整体生存情况并没有得到显著的改善，卵巢癌患者5年生存率仅45%。因此卵巢癌被认为是妇科最恶性且预后较差的肿瘤之一。亟需探索卵巢癌潜在的发病机制，寻找新的特征分子作为抗肿瘤靶点和分子标志物，对提高卵巢癌的疗效和改善预后具有重要意义。

2.4 miR-125b-5p在卵巢癌细胞内负调控CD147的表达，并抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移与侵袭

在SKOV3细胞中转染过表达质粒和对照质粒，转染成功后，过表达miR-125b-5p 组中miR-125b-5p的表达升高，而CD147的mRNA和蛋白表达明显下降（＜0.05，图4A～D)。过表达miR-125b-5p 后再转染pcDNA3.1-CD147，CD147的mRNA和蛋白表达明显升高（＜0.05，图4E～G）。Transwell 实验显示过表达miR-125b-5p后卵巢癌细胞的增殖、侵袭和迁移受到明显抑制，而过表达miR-125b-5p后再过表达CD147，卵巢癌细胞的增殖、侵袭和迁移的能力得到增强（图4H～I）。

3 讨论

政府会计制度改革是一个必然过程，在经济和社会发展的推动下，改革措施更适合当前的体制。虽然机构计费系统仍然存在，但随着社会经济的发展，在社会福利机构各部门的共同努力下，会计制度改革将会更加完善。现代事业单位会计制度增强了事业单位会计的资产管理能力，适应了制度的发展，同时也适应了社会的发展。

MiRNA被证实在多种肿瘤，如乳腺癌、膀胱癌、肝癌、喉部鳞癌和卵巢癌等的发生发展过程中均发挥着关键的生物学调控作用。miRNA几乎参与了与肿瘤发生发展的所有过程，包括增殖、凋亡、转移、血管生成和免疫应答等，其通过抑制信号网络中特定分子或重要的癌基因表达而发挥促癌或抑癌作用。有研究表明miR-125b-5p能阻断PI3K/AKT/mTOR信号通路，抑制胃癌和膀胱癌细胞的生长和增殖，也可通过靶向调控TXNRD1抑制肝细胞癌的增殖和迁移。这提示miR-125b-5p能通过阻断信号通路和靶向基因表达，从而抑制癌细胞的增殖。另外，有多项研究提示miR-125b可能在抑制卵巢癌的发生发展过程中起关键作用。通过本研究证实miR-125b-5p在卵巢癌组织和癌细胞株中均低表达，这一结果与先前研究报道一致。为探索其在卵巢癌中的作用，随后通过过表达miR-125b-5p后，卵巢癌细胞SKOV3、HO8910的增殖、侵袭和迁移能力均受到明显抑制，相反，抑制miR-125b-5p 后，卵巢癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力明显提高。这些结果表明miR-125b-5p 在抑制卵巢癌细胞的增殖、侵袭和迁移等生物学功能的重要调控作用。

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考虑到miR-125b-5p在卵巢癌中的关键作用，很有必要进一步探讨miR-125b-5p表达的转录调控机制。而CD147作为一种黏附分子，在很多恶性肿瘤细胞中高表达，被认为是肿瘤进展过程中的重要基因，通过在肿瘤细胞和基质细胞中诱导基质金属蛋白酶和血管生成因子，影响肿瘤细胞的生物学行为，包括转移和侵袭。课题组前期在一项前瞻研究中，已证实CD147与卵巢癌恶行程度正相关，并通过体外的血管生成实验已证实CD147能激活HIF-1α/VEGF信号通路，促进卵巢癌的血管形成过程，最终参与卵巢癌的发病过程，但其调控的上下游分子机制还有待进一步研究。以上结果提示调控CD147的上游信号分子机制或许亦可为卵巢癌进展研究提供关键的理论基础。因此基于以上研究结果以及文献提示，我们思考miR-125b-5p是否通过调控CD147抑制卵巢癌恶行生物学行为？以及miR-125b-5p是直接调控还是间接调控CD147发挥作用？这均尚不清楚。本研究为解决这些问题，首先通过RTqPCR 实验，结果显示卵巢癌组织和细胞株中miR-125b-5p低表达，而CD147高表达，这一结果和课题组研究结果一致。随后通过Pearson相关性分析明确二者为负相关。CD147能促进卵巢癌的增殖、侵袭和迁移，而miR-125b-5p的作用相反，二者之间的调控机制还有待进一步研究。

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通过Starbase在线数据库预测显示，miR-125b-5p与CD147具有潜在结合位点，随后使用双荧光素酶报告基因实验进行验证，明确miR-125b-5p可直接靶向CD147发挥作用。随后通过细胞转染发现过表达miR-125b-5p后，CD147蛋白和mRNA的表达均降低，而沉默miR-125b-5p后，CD147的蛋白和mRNA表达均会增加。这证实miR-125b-5p能靶向结合并负调控CD147。另外，通过Transwell实验进一步研究miR-125b-5p与CD147的相互作用对卵巢癌细胞的影响。通过细胞转染后，沉默miR-125b-5p能促进卵巢癌细胞的侵袭和迁移，过表达miR-125b-5p后，卵巢癌细胞的侵袭和迁移受到明显抑制，随后进行rescue 实验，过表达miR-125b-5p 后再过表达CD147，卵巢癌细胞的侵袭和迁移的能力恢复，这证实了miR-125b-5p通过负调控CD147，从而抑制了卵巢癌细胞的侵袭和迁移的能力。本研究首次证实miR-125b-5p通过靶向CD147促进卵巢癌细胞侵袭转移，这为卵巢癌的诊疗提供新的实验证据。

这里使用DDR2存放算法的激励,具体内存条型号是MT4HTF3264HY。采用Xilinx的IP核MIG产生DDR2控制器,DDR2控制器经分层处理,可以简化设计并使其模块化[13]。

综上所述，本研究证实miR-125b-5p可通过直接靶向卵巢癌重要调控基因CD147的表达，从而抑制卵巢癌细胞的迁移与侵袭的能力。本研究通过了解miR-125b-5p在卵巢癌发生发展中的作用，为进一步理解卵巢癌的发生机制以及为卵巢癌的诊疗靶点选择提供新的理论依据。