百合LbKCS5和LbKCS17基因的克隆与表达分析

赵子贤，刘 立，谢 天，阎俊卉，文锦芬

(昆明理工大学 建筑与城市规划学院，昆明 650500)

无论是低等植物还是高等植物其表面都覆盖有蜡质[1]，植物表皮蜡质层的存在，在保持组织和器官功能、保证植物正常发育等方面起了重要的作用，在抵御各种环境胁迫如非生物胁迫强光、紫外线辐射、低温和干旱[2-4], 生物胁迫如细菌和真菌病害以及昆虫等[2,5]蜡质也具有重要的意义。植物表皮蜡质的组成成分复杂多样，目前发现统计有100多种，其碳链长度多在20～34个碳原子之间，主要由超长饱和脂肪酸链(very long chain fatty acids，VLCFAs)及其衍生物组成[6-7]。

在蜡质的生物合成过程中，脂肪酸延伸酶复合体FAE由 4 种酶构成，其中β-酮脂酰辅酶A合成酶(KCS)是限速酶，具有严格的底物特异性，VLCFA 链的长度由KCS决定[8]。目前在拟南芥基因组中发现了21个KCS基因，根据它们氨基酸序列的相似性，分为4个亚族：FAE1-like、KCS1-like、FDH-like和CER6；其中KCS2/DAISY 和KCS20参与C20到C22 VLCFAs的延伸、KCS9参与C22到C24 VLCFAs的延伸，而 KCS1 和CUT1/CER6/KCS6则参与C24 VLCFAs的进一步延伸[9]。

百合(Liliumbrowniivar.viridulumBaker)属于百合科百合属，作为一种重要的花卉，是世界公认的五大切花之一，在中国切花种植中百合的种植面积仅次于玫瑰[10]。切花百合在采后和运输过程中由于失水导致花朵畸形和花早衰，影响花的品质，降低其商品价值。花蕾表皮蜡质对花的耐失水胁迫能力有重要的意义，研究切花百合蜡质及代谢机理，对切花百合育种、生产和销售均具有重要的实践意义。

虽然在拟南芥、水稻、小麦、脐橙和苜蓿等植物中对KCS进行了研究，但在观赏园艺特别是百合中的研究则尚未见报道。本研究以切花市场的常见百合品种‘黄天霸’为材料，克隆了LbKCS5和LbKCS17，对其蛋白特性进行了生物信息学分析，并对这2个基因在百合不同器官、花蕾不同发育时期、低温和失水胁迫下的表达进行了分析，为探究LbKCS5和LbKCS17基因在百合发育和非生物胁迫中的作用提供理论支持。

1 材料和方法

1.1 植物材料及处理

实验材料为多头百合‘黄天霸’，切花与种球购于斗南花卉市场(中国昆明)，昆明理工大学农工楼实验室室温培养。

1)花蕾发育4个时期(图1)，绿蕾期(花蕾全为绿色，紧实)、黄蕾期(花蕾变成黄色，蓬松未开放)、盛花期(花瓣完全展开，颜色最鲜艳)和衰败期(花瓣开始出现萎蔫)，取花瓣(最外层花瓣)、叶(花下第一片叶)为材料，分析花蕾不同发育时期花瓣和叶中的基因表达。2)盛花期花瓣(最外层花瓣)、叶片(花下第一片叶)、根、鳞茎(最外层鳞片)、花药、雌蕊和雄蕊(图2)为材料进行基因表达研究。3)由于切花百合主要在绿蕾期进行采收，在运输过程中容易受到失水及低温胁迫，故以绿蕾期的花为材料进行胁迫处理[11-12]。失水胁迫处理：将绿蕾期的切花，修剪花茎长度为5 cm用蒸馏水洗净擦干插入空瓶，对照组插入蒸馏水中，然后将材料放入光照培养箱中，23 ℃、14 h光照/21 ℃、10 h黑暗处理，光通量密度 400 μmol·m-2·s-1，相对湿度55%；低温胁迫处理：将绿蕾期的切花，修剪花茎长度为5 cm，插入蒸馏水，放入光照培养箱中低温(4 ℃)处理14 h光照/10 h黑暗，光通量密度 400 μmol·m-2·s-1，相对湿度55%。分别在处理 0、3、6、9、12、24 h时取材。

1.2 方 法

1.2.1 RNA提取和反转录使用Trizol法提取，参照尹慧等[13]和迟博文等[14]的方法提取RNA，反转录使用赛默飞世尔公司(Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit)试剂盒，严格参照说明书进行操作，反转录得到的cDNA第一链分装低温保存备用。

1.2.2 cDNA克隆根据NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中检索到LbKCS5和LbKCS17同源cDNA序列采用Primer Premier 5.0设计特异性引物，引物序列见表1。利用反转录得到的cDNA第一链进行PCR扩增，试剂盒参照宝生物公司Taq酶(TaKaRa TaqTM)，PCR反应程序：变性98 ℃10 s，退火30 s(LbKCS5和LbKCS17退火温度分别为50.6 ℃，51.7 ℃)，延伸72 ℃ 1 min/1 000 bp，35个循环。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，得到明亮的条带且位置大小准确则送生物公司测序。

表1 基因克隆和qRT-PCR引物

1.2.3LbKCS5和LbKCS17基因的生物信息学分析用DNAMAN进行氨基酸序列比对，MEGA7.0进行系统进化树分析[15]，在线软件SOPMA(http://npsa-pbil.ibcp.fr/)进行蛋白质二级结构预测，SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)进行蛋白质三级结构预测，EXPASY(http://us.expasy.org/tools/pi_tool.html6.)计算等电点(pI)和分子量(Mw)，PSORT(http://psort.hgc.jp/)进行亚细胞定位预测，TMHMM-2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)进行跨膜结构预测，MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)进行蛋白的基序分析[16]。

1.2.4LbKCS5和LbKCS17基因表达特异性分析根据LbKCS5和LbKCS17同源cDNA序列采用Primer Premier 5.0设计基因特异性引物，引物序列见表1，内参基因为actin(JX826390)。根据引物进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析，使用Hieff®qPCR SYBR®Green Master Mix(No Rox)

试剂盒参考说明书进行操作，反应体系：Hieff®qPCRSYBR®Green Master Mix:10 μL，正反引物各0.4 μL，模板DNA 2 μL，无菌超纯水 7.2 μL。扩增程序：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，40个循环，每个样品3个重复，采用2-ΔΔCT方法计算相对表达量。利用Excel 2010计算表达量，SPSS 18.0进行方差分析，Sigmaplot12.5作图。

2 结果与分析

2.1 LbKCS5和LbKCS17基因克隆

以‘黄天霸’绿蕾期的花cDNA为模板，对LbKCS5和LbKCS17进行特异性引物扩增，得到长度分别约为700和1 200 bp的2条片段(图3)，经测序分析，LbKCS5和LbKCS17的扩增长度分别为689和1 228 bp。

利用Prot Param软件分析，经开放阅读框预测分析，LbKCS5基因长度为689 bp，编码186个氨基酸残基；LbKCS17长度为1 238 bp，编码291个氨基酸残基；LbKCS5和LbKCS17蛋白相对分子量分别为21.297kD和32.908 kD，理论等电点分别为9.37和9.28。

2.2 亚细胞定位和跨膜结构预测

对这2个蛋白质的亚细胞定位进行预测，发现LbKCS5和LbKCS17最有可能定位在细胞质。通过在线工具TMHMM-2.0对LbKCS5和LbKCS17蛋白的跨膜结构进行预测，结果表明LbKCS5蛋白可能是一个与细胞信号传导有关的膜受体蛋白，其中1～14位氨基酸位于细胞膜表面，15～34、166～185位氨基酸之间形成2个典型的跨膜螺旋区；而LbKCS17蛋白预测为不含跨膜螺旋区。

2.3 LbKCS5和LbKCS17基因编码蛋白的结构预测

使用SOPMA进行二级结构预测，结果表明LbKCS5蛋白的α螺旋占氨基酸残基总数的67%、LbKCS17占43.64%；β-转角在LbKCS5蛋白中占氨基酸残基总数的6.53%、LbKCS17中占6.53%；无规则卷曲在LbKCS5中占6%、LbKCS17中占35.05%；延伸链在LbKCS5中占18%，LbKCS17中占14.78%。通过在线工具MODELING进行三级建模，结果显示LbKCS5和LbKCS17蛋白三级结构主要是由α螺旋、β-转角、无规则卷曲和延伸链构成，与二级结构预测一致。

2.4 LbKCS5和LbKCS17的氨基酸序列及基序分析

使用在线软件MEME进行蛋白motif分析(图4，Ⅰ-A)发现，LbKCS5蛋白与4种植物的motif位置前后较相近，其中包含3个相似motif；图4，Ⅰ-B中字母高低代表氨基酸序列的出现频率大小，motif 1和motif 2、motif 3的氨基酸序列相比存在大约69%和73%、87%的差异，推测motif 1在5种植物生长发育中起到了关键的生物学作用。图4，Ⅱ-A中，LbKCS17蛋白与菠萝的motif 位置大小最相近，与木樨榄、野大豆较为相近，motif 1、2、3、4(图4，Ⅱ-B)的氨基酸序列相比存在30%、47%、48%、63%的差异。结果表明，motif 1在5种植物生长发育中起到重要作用。

2.5 LbKCS5和LbKCS17的系统进化分析

通过Blast序列比对(图5，Ⅰ)发现，LbKCS5与油棕(Elaeisguineensis)、海枣(Phoenixdactylifera)序列相似性最高，分别为82.61%和81.37%，与亚麻荠(Camelinasativa)等植物相似性为77%～80%；LbKCS17(图5，Ⅱ)与莲(Nelumbonucifera)相似性最高，为77.62%，与番茄(Solanumlycopersicum)等相似性为75%～77%。利用InterPro(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)进行保守结构域分析(图5，Ⅰ)，LbKCS5在2～36、51～132个氨基酸处含2个保守结构域，分别为IPR013601：FAE1 typ3 polyketide synth(FAE1/Ⅲ型聚酮合酶)、IPR013747: ACP syn Ⅲ C(3-氧代酰基-酰基载体蛋白合酶)；LbKCS17(图5，Ⅱ)在1～160和177～257个氨基酸处有2个成分复杂度较低的保守结构域，分别为IPR013601：FAE1 typ3 polyketide synth(FAE1/Ⅲ型聚酮合酶)、IPR013747: ACP syn Ⅲ C(3-氧代酰基-酰基载体蛋白合酶)，说明这些保守结构域在不同物种存在着相似的生物学功能。

通过系统进化树(图6，Ⅰ)分析发现，LbKCS5与山药(Dioscoreacayenensissubsp.rotundata)、海枣(Phoenixdactylifera)、姜(Zingiberofficinale)进化水平较接近且在同一分支中，与亚麻荠、烟草(Nicotianaattenuata)进化水平较远。如图6，Ⅱ所示，LbKCS17与菠萝、莲、油棕进化水平较接近且在同一分支，与番茄、中华辣椒(Capsicumchinense)等茄科植物进化水平较远。

2.6 LbKCS5和LbKCS17基因在百合器官中的表达

如图7所示，在‘黄天霸’营养器官中，LbKCS5的表达量以根中最低，叶中最高；在花器官中LbKCS5的表达量依此为雄蕊>雌蕊>花药>花瓣；LbKCS17表达量也是在根中最低，叶中最高；在花器官中的表达则是在花药中最高，雄蕊次之，花瓣中最低。

2个基因在花蕾发育不同时期的表达如图8所示，LbKCS5在花瓣和叶中的表达均先增加后下降，在黄蕾期达到最大值(图8，A)。LbKCS17在花蕾生长发育过程中，在花瓣中的表达先升高后降低，在黄蕾期和盛花期表达最高；在叶中其表达相对较低，也是在黄蕾期表达量达到峰值(图8，B)。

2.7 不同胁迫下LbKCS5和LbKCS17基因的表达

如图9所示，失水胁迫能诱导LbKCS5和LbKCS17表达量升高。其中，LbKCS5在失水胁迫处理6 h高于对照(图9，A)，在9 h与对照差异显著，12 h达到峰值；LbKCS17则在处理3 h高于对照，在6 h时与对照差异显著，到24 h时其表达量仍在增加且与对照差异显著(图9，B)。

图10显示低温处理下2个基因的表达。LbKCS5在12 h前低于对照，在12 h时达到最高峰并且显著高于对照(图10，A)；但低温未能诱导LbKCS17的表达增加，与对照相比反而降低了其表达量(图10，B)。

3 讨 论

植物表皮蜡质是覆盖在植物表面的一类不溶于水而易溶于有机试剂的物质。VLCFA是蜡质合成的重要前体，KCS是植物合成VLCFAs的关键限速酶，该酶催化 C2单元从丙二酰-CoA 缩合为酰基-CoA，决定了VLCFAs的合成速率和碳链长度[17]。

研究表明，在百合营养器官中LbKCS5和LbKCS17均有表达，这2个基因在叶中表达量最高，而在根中最少；在拟南芥中发现KCS4 主要在芽和根顶端分生组织、叶脉、成熟和发芽的花粉粒以及发育中的胚中表达[17]，KCS10 在植株地上部分表达，而在根中为最少[18]。KCS在蒺藜苜蓿叶、花器官和茎顶端分生组织，但在根中表达水平较低[19]；Pruitt 使用原位 RNA 杂交技术分析表明KCS10 基因定位于拟南芥的茎、叶和花瓣等表皮细胞，但在根中几乎无信号[20]。此外，在大麦中的研究也暗示，KCS基因表现出不同的组织表达模式[21]。

本研究在花器官中的表达结果显示，在雄蕊中LbKCS5的表达量最高，LbKCS17则在花药中最高，在花瓣中二者的表达量最低。脐橙中CsKCS6在所有组织中均有表达，在柱头中检测到最高表达[22]；Yang等[23]研究表明，在柑桔中CsKCS2和CsKCS11主要在果实的外皮表达，且它们的表达随着成熟而急剧增加。在百合花蕾生长发育过程中，本研究结果表明花瓣和叶中2个基因的表达均先升高后下降，花瓣中2个基因的表达在黄蕾期达到峰值，在黄蕾期的叶中LbKCS5表达量最高。此外，Cheng等[24]在百合的绿蕾期和盛花期对花瓣中蜡质种类和含量检测结果表明，随着花的发育花瓣中蜡质种类增加，蜡质含量升高，结合本研究中LbKCS5和LbKCS17基因在百合不同器官及花蕾不同发育阶段中的表达变化，因此推测LbKCS5和LbKCS17可能参与百合表皮蜡质的生物合成。

植物表皮蜡质作为植物和环境间的第一道屏障，对植物体内水分的维持有重要意义。作为蜡质脂肪酸合成通路中的限速酶，故推测当植物受到非生物胁迫时，KCS有可能会做出相应应答。在苹果果皮中发现8个MdKCS基因在干旱、脱落酸 (ABA) 和 NaCl 处理下被显著诱导表达[25]；此外，Guo等[22]在脐橙中也发现CsKCS6的转录因干旱胁迫、盐胁迫和脱落酸(ABA)处理发生了变化，在拟南芥中过表达该基因则提高了转基因植株抗非生物胁迫的能力。本研究中，失水和低温处理均能诱导切花百合中LbKCS5的表达；失水胁迫提高了LbKCS17的表达量，但低温却降低了其表达量，且LbKCS17对失水胁迫响应更敏感。由此可见，LbKCS5和LbKCS17对这两种非生物胁迫有响应，这也为将来提高百合耐失水、低温的胁迫能力提供了可行途径和理论支持。

本研究通过克隆百合切花蜡质合成的关键基因LbKCS5和LbKCS17，分析了他们在百合不同器官、花发育不同阶段的表达模式以及在失水和低温胁迫下的表达，为通过调控百合切花中LbKCS5和LbKCS17的表达，进一步调控百合切花中蜡质含量，提高切花在采后和长距离运输中的耐失水和低温胁迫能力，避免因胁迫导致的花蕾畸形、早衰，最终延长切花的瓶插期，提高切花的质量提供了可能。