罗汉松雄球花及其雄配子体发育的形态结构

朱栗琼，蒙东萍，招礼军

(广西大学 林学院, 广西森林生态与保育重点实验室, 南宁 530004)

自然界中种子植物个体和种群数量的增多及种质基因的延续主要靠其成功的有性生殖来实现，若生殖过程中有任何一个环节出现异常，都将不同程度地导致生殖失败，因此了解植物的有性生殖、特别是植物大、小孢子的发生和雌、雄配子体的发育规律具有重要意义，并可以根据其发生和发展的机理，人为采取合理的措施控制其生长发育过程，达到生产上的高产、优质目的[1-2]。

罗汉松(Podocarpusmacrophyllus)属于罗汉松科(Podocarpaceae)罗汉松属(Podocarpus)植物，主要分布在中国南部各省。罗汉松为常绿乔木，树型优美，枝干耐盘扎，对干旱、瘠薄环境有较强适应性，具有良好的观赏效应和改善环境的作用。罗汉松内含的酯类化合物[3]、双黄酮化合物等药用成分被挖掘[4]，已被证实具有一定医疗价值，罗汉松的盆景制作与赏析[5]、生理特征[6]、形态结构[7-8]、遗传多样性[9]、培育方法[10]及其根瘤特性[11-12]等方面也有相关报道，而关于其生殖生物学的报道资料较少。本研究在罗汉松雄球花的分化和发育过程中，分阶段取样制片，通过光学显微镜和扫描电镜观察其形态结构特征，以期掌握罗汉松小孢子的发生和雄配子体的发育规律，为罗汉松的生殖和杂交组合提供胚胎学证据，并为其选育工作提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 样地概况

罗汉松样地位于南宁市广西大学校园内，位于107°45′～108°51′E，22°13′～23°32′N，地貌为典型低山、丘陵，平均海拔76.5 m，属南亚热带季风气候，阳光充足，霜少无雪；年平均气温21.7 ℃，冬季1月最冷，均温12.8 ℃，夏季7、8月最热，均温28.2 ℃；年平均降雨量1 298 mm，干湿季较明显，夏季为雨季，秋冬季偏干旱[13]。

1.2 试验方法

1.2.1 开花物候观察通过查询和观察了解到罗汉松花芽通常在10月中下旬开始分化，本实验2018年10月10日开始，选择5株长势良好、树体健壮的成熟罗汉松雄株样树，于树干中部向阳面的位置选取5～10根枝条，每枝条上标记10～20个花芽，研究罗汉松雄株群体从花芽分化至散粉的生长发育情况，每7 d观察和采集5个雄球花一次(休眠期除外)，并进行拍照记录，样本置于FAA液保存。

1.2.2 花粉形态电镜扫描参照罗敏蓉等[14]的方法，于盛花期随机选择样树正常花序10枝，置于牛皮纸袋中将花粉抖落并装入2 mL离心管密封，4 ℃冰箱保存。制片时通过2.5%戊二醛固定-磷酸缓冲液清洗3次-乙醇逐级脱水-干燥仪干燥-粘片-观察-拍摄(Hitachi SU8220电子扫描显微镜)，随机选择花粉粒各角度20个界面拍摄，观察和计算各特征值，取其平均值为数量特征值。

1.2.3 石蜡切片制片方法参照赵铅等[15]的方法(适当改进)对采集的罗汉松雄球花制片，具体步骤为：经过乙醇逐级脱水-TO型生物制片透明剂透明-透蜡(54～56 ℃熔点)-包埋-切片(6～8 μm)-烘片-乙醇逐级脱蜡-复水-染色(0.05%甲苯胺蓝)-封片(中性树胶)等，用于制片的花序每阶段样本至少10枝，随机切片30张。通光学显微镜对上述固定片进行观察和拍摄，重点观察的内容有：小孢子囊壁的发育、小孢子的发生、雄配子的发育等。

2 结果与分析

2.1 罗汉松雄球花生殖物候及外形特征

经观察，罗汉松雄球花均为腋生。每年的9月花芽分化已基本完成，至10月圆锥状单生雄球花出现，外有2层苞片包被，后持续发育成卵圆形，苞片由浅绿色逐渐转变为棕黄色(图1，A)，球花顶端逐渐出现凹痕，至11月中下旬，凹痕加深并将花芽一分为二或三个(图1，B)，形成簇生花序，持续生长至12月中旬，花序体积有所增大，颜色进一步加深(图1，C)。12月下旬至次年2月，雄球花生长发育进入相对停止时期，外形、颜色、大小无明显变化；进入3月，雄球花快速生长，首先是浅绿色球花撑裂苞片(图1，D)，穗状球花上螺旋状着生小孢子叶球(图1，E)，随着时间的推移。小孢子叶球颜色依次转变为黄绿色、黄色，花序轴及小孢子叶的迅速生长，使得雄球花的体积也明显增大。罗汉松雄球花初始散粉发生于3月中旬，4-5月中旬为群体雄球花的盛花期(图1，F)，至5月下旬或六月初所有雄球花基本枯萎变为褐色，但还能在枝条上续存较长时间。

2.2 罗汉松小孢子叶的发育

圆柱形的罗汉松雄球花上螺旋状着生有许多小孢子叶(图2，A)，小孢子叶的远轴面基部并列着生2个小孢子囊，即花粉囊，初生的小孢子囊由表皮和孢原细胞组成。

2.2.1 小孢子囊壁的发育小孢子叶分化形成初期，由其外侧近中轴的基部孢原细胞快速分裂，形成的新细胞向内分化为造孢细胞，向外分化为初生壁，后者进一步分化成3层形态上有明显差异的细胞，由外及里分别是药室内壁、中层和绒毡层，各层均只有1层细胞，加上最外层的表皮细胞，小孢子囊壁发育成有4层细胞组成的结构(图2，B)。其中表皮细胞在生长初期顶端与基部的细胞差异较明显，纵切面上看，顶部细胞近长方形，越近基部的表皮细胞与内部的孢原细胞形态越相似，近方形，但均排列较整齐而紧密，具有明显的液泡和细胞核。随着内部造孢细胞的形成，表皮的主要轮廓逐渐显现，细胞体积增大，液泡化更明显，至单核小孢子时期，表皮细胞生长至体积最大，各细胞形状也呈现差异，同时外壁出现角质层，直至花粉粒发育成熟时，小孢子囊的表皮细胞壁角质化达到最厚(图2，B中B1所示)。

药室内壁位于表皮之下，由孢原细胞分化形成。药室内壁由一层薄壁细胞组成，横切面上呈长方形，比表皮细胞体积大，但细胞质颜色更深，内含物丰富，细胞核占比更大。当小孢子母细胞进入减数分裂期和单核小孢子发育初期时，药室内壁细胞变化明显，细胞径向伸长迅速，外形上更扁平，内含物增多，颜色进一步加深，细胞壁上出现带状纤维加厚，此时的药室内壁亦可称为纤维层。当花粉发育成熟时，纤维层细胞径向扩展达到最大，细胞内含物几乎消失殆尽，细胞核也随之解体成为死细胞。中层在纤维层之内，主要出现在孢子母细胞减数分裂时期，在小孢子囊壁中呈扁平状，细胞体积最小，细胞质浓，细胞核大，内含物丰富，中层存在的时间较短，当减数分裂结束时，中层细胞的原生质体会逐渐减少，形态变得更小且不规则，在花粉发育成熟前被分解吸收。绒毡层居于小孢子囊壁最内层，细胞体积较中层细胞偏大，细胞质浓，发育初期细胞核逐渐由单个变为多个，整齐地排列在中层细胞内侧，至单核小孢子时期，绒毡层细胞体积已达最大，随之细胞质发生浓缩，颜色加深，当花粉发育成熟初期，绒毡层细胞体积变小，颜色变浅，慢慢降解，最终被吸收消失(图2，B中B2所示)。因此，罗汉松小孢子囊壁的结构从最初的一层表皮细胞发育成四部分组成，当花粉粒发育成熟时又仅剩两部分，即表皮和纤维层。散粉前，纤维层细胞因干燥收缩使小孢子囊壁撕裂，花粉粒得以散发出来。

2.2.2 小孢子的发生与发育小孢子囊形成初期是由一层表皮细胞包裹着若干个孢原细胞组成，然后由孢原细胞平周分裂进一步产生孢子囊壁细胞和造孢细胞。造孢细胞初期为不规则多边形，排列紧密，胞间连丝明显，细胞质颜色浓，细胞核大，并可见多个核仁。随着进一步的分裂，细胞数量增多，体积也增大，细胞逐渐变成近圆形，胞间隙变大，同时细胞壁出现胼胝质，造孢细胞进入小孢子母细胞发育时期(图2，C)。进入减数分裂期时，同一个小孢子囊中可看到处于不同分裂时期的小孢子母细胞(图2，D)，即罗汉松小孢子母细胞发育出现不等同性。

减数分裂的第一次分裂末期两个核分别移向两级，形成二分体(图2，E)，随后两核各分裂一次形成四分体，四分体有四面体型和十字交叉型两种排列方式，后者数量比例上占多数(图2，F)。四分体形成后，细胞表面的胼胝质逐渐溶解消失，四分体相互分离形成单核小孢子，此时的单核小孢子细胞质浓，具有2层细胞壁，外壁上有网状花纹，并由外壁逐渐延伸形成2个对称的气囊，气囊上也具有网状花纹(图2，G)，气囊的发生开始于四分体时期。

2.3 罗汉松雄配子体的发育

雄配子体的第一个细胞就是单核小孢子。单核小孢子的进一步发育首先表现在细胞中逐渐形成一个大液泡，将细胞质及细胞核挤压至细胞壁边缘，随后细胞核发生第一次分裂，形成第一原叶细胞和胚性细胞，前者近圆形，较大，居于花粉粒中央，后者处于花粉粒近极面，形如一轮弯月。后胚性细胞发生分裂形成第二原叶细胞和精子器原始细胞，前者位于花粉粒近极面，靠近第一原叶细胞，形态和大小与第一原叶细胞相似，后者居于花粉粒中央，与胚性细胞形态相似。精子器细胞经过短暂生长后分裂形成1个生殖细胞和1个粉管细胞，后者居于细胞远极面。至此，雄配子体发育成熟(花粉粒)(图2，H)，2个原叶细胞在生殖细胞形成时先后逐渐被吸收，有的甚至消失，因此成熟雄配子体大部分最后只有生殖细胞和管细胞(图2，I)，属于二细胞花粉粒。

2.4 成熟花粉粒微形态特征

扫描电镜显示，罗汉松花粉与松属植物的花粉相似，花粉粒由本体和两个气囊组成(图3，A)。近极面和远极面观察均为椭球状，侧面看形似一顶带耳的帽子(图3，B)，两个气囊位于本体对称的两侧，展开的角度较大，和本体连接处较薄，向远端逐渐加厚，表面均有不规则的波浪状褶皱，近极面和远极面观察气囊均呈耳形，而侧面看呈耳垂形，表面密集穴状雕纹。经测量，罗汉松花粉粒平均长为40.502 μm，花粉粒本体平均长21.965 μm，厚15.389 μm，两者之比约为0.7，呈阔椭球状，本体近极面的“帽”外壁加厚，表面有颗粒状和条纹纹理，排列不规则，侧面能看到“帽缘”上具密集瘤状结构，本体远极面中部具一较深的萌发沟，沟的表面粗糙不平，具颗粒状和网状纹理，沟的周围还有瘤状突起(图3，C)。

3 讨 论

繁殖是植物的重要生命现象之一，是实现物种的延续、扩大及进化的基础。有性生殖作为最高级的繁殖方式，其中配子体的发生和发育过程中每一环节对植物有性生殖的顺利进行均至关重要[16]。松杉植物的花粉根据其内部所存在的细胞数量一般分为3种类型：三细胞的银杉型，代表植物是银杉；四细胞的松型，包括松科和罗汉松科的绝大多数植物；五细胞的油杉型，如雪松属、冷杉属、落叶松属、云杉属、油杉属等归于此类[17]。实际上罗汉松成熟花粉粒中只有少部分含有2个退化的原叶细胞，介于2细胞和4细胞间，偏向2细胞型，红豆杉科和三尖杉科植物与罗汉松科植物亲缘较近，它们的花粉属于二细胞型，无原叶细胞，因此将罗汉松花粉类型归为二细胞型更合理。

总体来看罗汉松雄配子体的发育过程较顺利，如下特性为其起到保驾护航的作用：

(1)小孢子囊的起源方式对小孢子的保护作用。罗汉松小孢子囊从一开始分化就同时具有表皮细胞和孢原细胞，前者包被于后者之外，对幼嫩组织营造了一个稳定的环境，有利于小孢子母细胞及后续发展。这种发育方式与大部分的裸子植物相似，如水松等[16]，少部分裸子植物的孢原细胞分化时无表皮细胞的保护，裸露于小孢子叶基部，如花旗松[17]。

(2)减数分裂的时机有利于确保其正常进行。减数分裂是植物有性生殖的最进化的方式，不仅保障了子代与父母本的遗传稳定性，同时实现了子代的遗传变异，使后代的适应能力增强。有性生殖过程中母细胞的减数分裂对环境的变化特别敏感，如温度、水分、光照、营养等的异常均能影响减数分裂的正常进行，从而影响植物的结实产量和质量。罗汉松以造孢细胞发育后期的状态进入休眠，因此小孢子母细胞的减数分裂发生在温暖湿润的春季，避开了干旱而低温的冬季，为其发育创造了良好的外界环境条件。裸子植物减数分裂的时机因种而异，如红豆杉属[17]植物多数情况下小孢子母细胞在休眠前已完成减数分裂，并发育成配子体；欧洲赤松、白云杉等[17]与罗汉松相似，小孢子母细胞在冬季休眠，春季解除休眠后进行减数分裂。母细胞与子细胞相比较而言抗性强，同时在发育时间足够的前提下母细胞营养物质的积蓄有利于提高子细胞的生活力，因此休眠后再进行减数分裂的方式不免为一种进化方式。

(3)花粉粒发育时间的不等同性可保障授粉的成功率。在减数分裂时期可在同一个小孢子囊中看到处于不同分裂时期的小孢子母细胞，可知罗汉松花粉粒的成熟步调不一致。此现象可能与发育过程中营养物质供给或者光照、温度、水分等外部条件有关[18-19]，不过可延长传粉时间，增加授粉的成功率，可认为是植物适应环境的一种进化表现[20-21]。从实际观察到结实率较高的现象来推断，罗汉松的花粉粒发育成功率较高，保障了授粉所需数量和质量。生产上若需配子体发育实现同步性，可采用辅助授粉、改良培育技术或使用激素处理等方式实现，只要保证授粉的完全性，亦可达到提高种子的产量与质量的目的[22-23]。观察中发现罗汉松极少数小孢子囊的内部有时会形成空腔，估计是小孢子数量多，营养的有限性促使某些小孢子母细胞降解为换取其他小孢子的正常发育[24]，符合优胜劣汰的生存原则。

罗汉松属有不少优良的盆景素材，如珍珠罗汉松、小叶罗汉松、贵妃罗汉松等都是盆景中的佼佼者，但以罗汉松的适应性较为突出，高大的外形使其在大型景观树中独具优势，因此可以把罗汉松作为优良的杂交母本，将其独特的基因引入同属植物，以获取观赏性和抗逆性更强的新品种。