不同佐剂对病毒灭活疫苗免疫效果的影响

文│王林浩 丁树龙 陈鼎 蔺凡 罗瑶瑶 刘金平（青岛易邦生物工程有限公司）

在生猪养殖中很容易感染猪细小病毒（PPV），导致妊娠期母猪流产、死胎、畸形胎等，还可能致使母猪不孕，仔猪出现皮肤炎症与腹泻等情况。此类病毒在全世界猪群内传播，威胁着整个养猪业的发展。在20世纪60年代发现PPV后，许多国家陆续检测到其抗体与病毒，并开始研究灭活疫苗。本试验以PPV HN-4株为例，根据其生物学特性，针对不同佐剂对PPV灭活疫苗在猪体中的免疫效果进行对比分析，为临床PPV预防和治疗提供科学依据。

一、试验材料与方法

1.材料与设备。

试验材料：PPV油乳佐剂疫苗、PPV铝胶佐剂疫苗、纳米铝胶佐剂疫苗、市场销售的油乳剂疫苗与PPV蜂胶疫苗；所用动物为出生一个月的断奶仔猪，数量为24头，经过HI和ELISA检验后，PPV抗体呈阴性。

仪器设备：源于苏静集团的超净工作台；源于上海宝峰集团的全波长酶标仪，型号为Thermo Fisher Scientific；源于欣康医疗器械公司的微量96孔血凝板；源于美国的型号为Accuri C6流式细胞仪；源于BioXL公司的ELISA试剂盒；源于日本Sanyo的二氧化碳培养箱。

2.操作方法。将试验所用的24头仔猪随机分成6组，每组4头。A组注射PPV油乳佐剂疫苗，每头2毫升；B组注射PPV铝胶佐剂疫苗，每头2毫升；C组注射纳米铝胶佐剂疫苗；D组注射市场销售的油乳剂疫苗；E组注射PPV蜂胶疫苗，每头2毫升；F组注射生理盐水，每头2毫升。上述各组均采用颈部肌肉免疫方式，在间隔14天后以相同剂量再次免疫。

3.测定方法。

（1）抗体水平检测。在接种0～6周之内，每周随机选取3头猪，对其前腔静脉位置采集血液样本，将血清分离后备用；将分离后的血清放入温度为56℃的环境下，水浴0.5小时，通过酸性为25%高岭土处理后，再用HI检验其抗体水平，生成抗体动态规律曲线；根据ELISA试剂盒的操作流程进行检测，借助ELISA原理对PPV抗体进行检验；抗体效价以标记酶的OD630指标为衡量标准，如若结果超过0.4，则为“阳性”；如若在0.2～0.4范围内则为“可疑”，如若结果低于0.2则为“阴性”。

（2）T淋巴细胞亚群检测。在接种0～6周之内，每周随机选取3头猪，对其前腔静脉位置采集血液样本，柠檬酸钠抗凝，分离淋巴细胞，利用PBS溶液控制细胞数量，将其提升到5.0×106/毫升，再利用流式细胞仪对T淋巴细胞亚群进行检验。

（3）血清抗体效价测定。在免疫接种3周后，随机选取3头猪进行静脉采血，血清分离后，放入温度为-20℃的冰箱内保存，以备检测。按照MEM培养液体积1%接种PPV疫苗，放入96孔板内，每个孔为100微升，在温度为37℃、浓度为5%的二氧化碳培养箱中培养，加入冷却后的乙醇，100微升孔固定，风干后，再加入5%脱脂乳到孔中，密封30分钟，用PBST洗涤3次。将事先准备好的血清用PBS稀释，再将100微升孔加入到96孔板内，在温度为37℃的摇床内孵育60分钟，利用PBSH洗涤3次后，将96孔板放入荧光显微镜下观察可得。

4.统计学处理。利用Excel和SPSS12.5软件对测定数据进行整合分析，得出各项指标均值，以Means±SD形式表示，再用SPSS软件实施Dun can’s深层分析。

二、试验结果

1.免疫猪血清HI检测结果。根据HI试验结果可知，不同组别的样本在接种后均会对猪体产生刺激，进而形成HI抗体，且抗体水平与免疫时长具有正相关关系，在接种后第一周，C组抗体水平明显超过B组；在接种第3周后，C组抗体水平达到最高值，与A组相比提前14天，与B组相比提前7天；A组抗体峰值相对最高，为11.58log2，C组次之，为11.24log2，B组排名第三，为10.95log2；以上三种疫苗在抗体峰值方面均超过D组与E组。在抗体水平方面，接种后第6周C组的抗体滴度达到9.72log2，A组为11.45log2，B组为9.87log2，这意味着B组的抗体滴度流失相对较快，A组相对较慢。

2.猪血清内抗体水平。经过ELISA试剂盒检测后，对不同时段收集到的血清抗体样本进行汇总，根据试验结果可知，不同组别样本在接种疫苗后均会使猪体受到刺激，形成抗PPV抗体，但在抗体水平、峰值时间方面有所区别。在接种后第二周，C组抗体水平超过B组；在接种第3周后，C组的抗体水平达到最大值，与A组相比提前7天；在接种第4周后，A组的抗体水平提高到最大，且与剩余组别间的差异具有统计学意义，P＜0.05；在抗体峰值方面，A组为最高，OD630值为0.624，C组次之，为0.431，B组排名第三，为0.264。

3.外周血内T淋巴细胞亚群变化。根据图1可知，在接种完毕后，各组样本的外周血T淋巴细胞亚群均发生改变，且数量与原本相比都有一定程度的提升，C组领先，与F组间差异具有统计学意义，P＜0.05；各组间差异不存在统计学意义，P＜0.05。

三、讨论

1.HI检测后猪抗体水平分析。血凝试验在PPV检测中的意义重大，该试验的操作便捷、经济性强，但对试剂配置要求较高，试剂准确度、判定时间、豚鼠红细胞配置浓度等都会影响试验成败。在试验期间，为了确保准确性与特异性不受影响，可用酸性高岭土对准备检测的血清进行处理，将内部非特异性血凝制物去除。根据研究结果可知，A组、B组和C组在接种后均会形成较高抗体滴度。三者中的C组抗体峰值出现时间较早，在接种后第三周便可达到最大值，与B组相比提前7天，与A组相比提前14天，且C组抗体水平在接种后首周明显超过B组，二者差异具有统计学意义，P＜0.05，但C组抗体滴度消耗相对较快，在三种疫苗中，A组抗体峰值水平为最高。

2.ELISA检测抗体水平分析。针对每周采集到的血清样本利用ELISA试剂盒进行检测，在接种后不同组别样本在接种疫苗后均会使猪体受到刺激，形成抗PPV抗体，但在抗体水平、峰值时间方面有所区别。在接种后第二周，C组抗体水平超过B组；在接种第3周后，C组的抗体水平达到最大值，与A组相比提前7天；在接种第4周后，A组的抗体水平提高到最大，与剩余组差异具有统计学意义，P＜0.05。对于上述两种抗体检测方式来说，在抗体消长规律方面基本相同，根据结果可知，三种佐剂疫苗中的C组抗体产生时间、峰值产生事件均相对较早，但抗体消降速度也较快，A组虽然抗体产生时间较晚，但消降速度较慢，持续时间相对较长。本研究对纳米佐剂能够提前诱导PPV的抗体应答进行验证，结果与前人研究基本相同，说明纳米佐剂之所以能够促进猪抗体应答提高，可能受纳米佐剂中的载体结构特性影响。

◎图1 免疫后猪外周血内T淋巴细胞占比情况

3.疫苗诱导细胞免疫应答。该试验对猪体外周血内的T淋巴细胞群进行检验，通过流式细胞仪完成，对多种佐剂疫苗接种后的细胞应答情况进行研究。根据研究结果可知，各组疫苗均可对猪体产生刺激，激发细胞免疫力，但不同组别之间差异无统计学意义，P＞0.05。与B组相比，C组T淋巴细胞亚群的占比相对较高，二者无统计学意义，P＞0.05，这说明三种疫苗均可对猪体细胞免疫起到一定强化功效。该试验制备的三种PPV疫苗在经过接种后，利用HI检测与ELISA检测后，均说明该疫苗可对猪体特异性产生促进作用，借助流式细胞技术对T淋巴细胞亚群变动情况进行检测，根据研究结果可知，PPV疫苗均可促进机体细胞免疫功能提升，说明具有较强的免疫原性、反应原性，为PPV疫苗研发与推广应用打下坚实基础。