铁皮石斛叶中黄酮碳苷类成分分离、鉴定及抑制α-葡萄糖苷酶活性研究Δ

冯海林，彭崇胜，李晓波（上海交通大学药学院，上海 200240）

铁皮石斛Dendrobium officinaleKimura et Migo是兰科石斛属多年生草本植物，药用历史悠久，是石斛药材来源的主要品种之一[1]。铁皮石斛的传统药用部位是茎，具有益胃生津、滋阴清热的功效，可用于治疗热病津伤、口干烦渴、阴虚火旺、骨蒸劳热等证[2]。铁皮石斛叶与茎的化学成分相似[3]，具有良好的降血糖[3]、抗氧化[4]等功效，但其降血糖的活性成分还未完全阐明。有研究发现，石斛属植物是小分子α-葡萄糖苷酶抑制剂的重要来源，例如：美花石斛茎中的菲类和茋类成分（loddigesiinols G～J）[5]、曲轴石斛中的新型芴-二氢菲类（dendrogibsol）和二氢菲成分（lusianthridin）[6]、铁皮石斛茎中的菲类成分（3，4-二羟基-4′，5-二甲氧基联苯和dendrocandin U）[7]，提示石斛属植物中小分子成分可能通过抑制α-葡萄糖苷酶活性发挥降血糖作用。然而，铁皮石斛叶中含量丰富的黄酮碳苷类成分[3]对α-葡萄糖苷酶的抑制活性尚未见报道。为了解铁皮石斛叶中黄酮碳苷类成分对α-葡萄糖苷酶活性的影响，本研究采用大孔吸附树脂和制备型高效液相色谱（HPLC）法对铁皮石斛叶中的黄酮碳苷类成分进行分离和纯化，通过紫外光谱（UV）、核磁共振（NMR）、高分辨电喷雾离子化质谱（HR-ESI-MS）等波谱方法对化合物结构进行推导和鉴定；通过体外实验方法评价各化合物的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用主要仪器有Bruker AVANCE 600型NMR波谱仪（美国Bruker BioSpin公司），6545型四极杆-飞行时间质谱仪、1200型HPLC仪、1260 InfinityⅡ制备型HPLC仪（美国Agilent公司），Nicolet 6700型红外光谱（IR）仪（美国Thermo Fisher Scientific公司），UV-1102型紫外可见分光光度计（上海天美科学仪器有限公司），P-2000型旋光仪、J-1500型圆二色光谱仪（日本JASCO公司）等。

1.2 主要药品与试剂

铁皮石斛叶由浙江铁枫堂生物科技股份有限公司提供，经上海交通大学药学院彭崇胜副教授鉴定为兰科石斛属植物铁皮石斛D.officinaleKimura et Migo的叶。α-葡萄糖苷酶（来源于酿酒酵母）购自美国Sigma-Aldrich公司；对-硝基苯基-α-D-吡喃葡糖苷（p-nitrophenylα-D-glucopyranoside，pNPG）购自上海麦克林生化科技有限公司；D101型大孔吸附树脂（规格0.3～1.2 mm）购自国药集团化学试剂有限公司；磷酸盐缓冲液（PBS，pH6.81）购自北京雷根生物技术有限公司；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）购自上海易恩化学技术有限公司；阿卡波糖片（批号BJ60665，规格50 mg）购自拜耳医药保健有限公司；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 提取分离

取干燥的铁皮石斛叶250 g，粉碎，加20倍量（mL/g）纯水，加热回流提取2次，每次2 h。水提物趁热过滤后减压浓缩至800 mL，再用无水乙醇室温醇沉24 h；将醇沉后的上清液抽滤，滤液减压浓缩至250 mL，经D101型大孔吸附树脂吸附，以甲醇-水（0∶10、1∶9、1∶4、3∶7、3∶2、19∶1，V/V）梯度洗脱，减压浓缩并真空干燥得6个主流分（Fr.1～Fr.6）。Fr.2～Fr.3采用制备型HPLC仪纯化得到以下化合物：化合物1[45 mg，由Fr.2经甲醇-水（50∶50，V/V）洗脱所得]、化合物2[13 mg，由Fr.2经甲醇-水（50∶50，V/V）洗脱所得]、化合物3[14 mg，由Fr.3经甲醇-水（50∶50，V/V）洗脱所得]、化合物4[25 mg，由Fr.3经甲醇-水（50∶50，V/V）洗脱所得]、化合物5[11 mg，由Fr.3经甲醇-水（50∶50，V/V）洗脱所得]。

2.2 化合物1～5的结构式

采用HR-ESI-MS、UV、IR，一维/二维NMR谱和圆二色光谱等方法推导了化合物1的结构式；通过测定HR-ESI-MS和NMR氢谱、碳谱（1H-NMR、13C-NMR），并与文献比较，鉴定了化合物2～5的结构。化合物1～5的结构式见图1。

图1 化合物1～5的结构式

2.2.1 化合物1 化合物1为淡黄色无定形粉末，易溶于甲醇，[α]25D-15.82（c 0.01，MeOH）；UV在波长270、335 nm处有最大吸收；IR提示含有羟基（3 385 cm-1）、芳香环（1 629、1 575、836 cm-1）和芳香酮（1 648 cm-1）。推测化合物1为黄酮碳苷。HR-ESI-MS显示质荷比（m/z）为561.161 1[M-H]-（计算值561.161 4），可推出该化合物的分子式为C27H30O13。1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz）谱（表1）在低场区显示出5组信号：δH14.04（1H，s，D2O交换）为黄酮母核5-OH的特征信号；δH8.32（2H，d，J＝8.8 Hz，H-2′/6′）和δH6.89（2H，d，J＝8.8 Hz，H-3′/5′）为 1组AA′BB′耦合系统信号，提示结构中有对位取代苯环；δH6.81（1H，s）可归属黄酮母核上 H-3的信号；δH10.25、6.08（各1H，s，D2O交换）提示黄酮母核上另有2个羟基取代；δH4.67、5.02（各1H）是糖端基氢信号。上述数据提示化合物1为芹菜素6，8-C-二糖苷，该化合物在ESI-MS/MS负离子模式下存在1组诊断离子（m/z为353.066 2、325.071 7、311.056 1、297.076 6），进一步确证了芹菜素6，8-C-二糖苷的推断[8]。13C-NMR（DMSO-d6，150 MHz）谱（表1）显示出2组糖基碳信号（10个次甲基信号：δC67.8，71.7，71.8，72.2，73.8，74.1，74.5，75.1，75.8，77.3；2个甲基信号：δC17.2，18.3），提示结构中存在鼠李糖和（或）异鼠李糖。1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz）谱（表1）显示出1组信号[δH8.32（2H，d，J＝8.8 Hz，H-2′/6′），6.89（2H，d，J＝8.8 Hz，H-3′/5′），6.81（1H，s，H-3），5.02（1H，s，H-1″），1.25（3H，d，J＝5.5 Hz，H-6″）]，与文献[9]报告的芹菜素-6-C-α-L-鼠李糖一致，提示结构中具有6-C-α-L-鼠李糖基取代。与 6-C-α-L-鼠李糖基芹菜素[6]比较，化合物1的1H-NMR数据多出1组脱氧己糖信号[δH4.67（1H，d，J＝9.8 Hz，H-1″′），1.18（3H，d，J＝6.2 Hz，H-6″′）]，而无H-8信号。因此，化合物1的结构可能是芹菜素-6-C-α-L-鼠李糖-8-C-α-L-鼠李糖或芹菜素-6-C-α-L-鼠李糖-8-C-α-L-异鼠李糖。二级质谱中观察到化合物1连续脱去C3H6O2和C4H8O3中性碎片而产生m/z分别为487.124 5和457.113 7的离子[8]；碎片离子m/z457.113 7继续脱去C2H4O、C3H6O2和C4H8O3中性碎片分别产生m/z分别为413.087 7、383.077 1和353.066 2的离子，确证该化合物为6，8-C-二糖苷的推断。进一步分析化合物1的1H-NMR数据发现，8位糖基的端基氢信号[δH4.67（1H，9.8 Hz）]与abyssionside A的8-C-β-D-异鼠李糖基[10]一致，而与香叶木素的8-C-α-L-鼠李糖苷基[δH5.43（2H，br s）]显著不同[11]。因此，推测化合物1的结构为芹菜素-6-C-α-L-鼠李糖-8-C-β-D-异鼠李糖。

表1 化合物1的1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz）和13CNMR（DMSO-d6，150 MHz）数据

异核多键相关（heteronuclear multiple bond correlation spectroscopy，HMBC）谱中观察到5-OH的氢信号与C-5、C-6、C-7和6-C-α-L-鼠李糖基的C-1″相关；而6-C-α-L-鼠李糖基的端基氢H-1″与C-5、C-6、C-7及6-C-α-L-鼠李糖基的C-2″、C-5″相关；8-C-β-D-异鼠李糖基的端基氢H-1″′与C-7、C-8、C-9及8-C-α-L-异鼠李糖基的C-2″′、C-3″′相关（图2）。图2给出了糖基部分氢原子相关光谱（1H correlation spectroscopy，1H COSY）信号，确认了氢信号归属。核欧沃豪斯效应谱（nuclear Overhauser effect spectroscopy，NOESY）中，H-2′/6′与8-C-β-D-异鼠李糖基的H-1″′、H-2″′相关，进一步确证了8-C-β-D-异鼠李糖基位置；而H-4″′与H-6″′相关，结合端基氢H-1″′与H-2″′之间的耦合常数（J＝9.8 Hz）进一步确证了相对构型（图3）。化合物1的圆二色光谱结果显示，在波长275 nm处呈现负Cotton效应，与芹菜素-6-C-α-L-鼠李糖-8-C-β-D-异鼠李糖的计算结果一致，支持8-C-β-D-异鼠李糖的构型。二维NMR谱和圆二色光谱支持化合物1的结构为芹菜素-6-C-α-L-鼠李糖-8-C-β-D-异鼠李糖。

图2 化合物1的主要1H COSY和HMBC相关信号

图3 化合物1的主要NOESY相关信号

2.2.2 化合物2 化合物2为淡黄色无定形粉末，UV在波长270、335 nm处有最大吸收，HR-ESI-MS显示m/z为563.141 1[M-H]-（计算值563.140 6），推测化合物的分子式为C26H28O14。二级质谱给出1组诊断离子（m/z为353.067 0、325.072 0、311.056 9、297.077 2），说明该化合物具有芹菜素-6，8-C-二糖苷结构[8]。碎片离子m/z353.067 0脱去1个C4H8O4和1个C3H6O3，未出现同时脱去2个C4H8O4的情况，说明结构中存在1个六碳糖基和1个五碳糖基[5]。1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz）δH：13.74（1H，s，加D2O后消失，5-OH），7.99（2H，d，J＝8.8 Hz，H-2′/6′），6.90（2H，d，J＝8.8 Hz，H-3′/5′），6.75（1H，s，H-3），5.01（1H，d，J＝10.0 Hz，H-1″′），4.58（1H，d，J＝9.7 Hz，H-1″）。13C-NMR（DMSO-d6，150 MHz）δC：163.6（s，C-2），102.6（d，C-3），182.2（s，C-4），159.2（s，C-5），108.2（s，C-6），161.2（s，C-7），105.1（s，C-8），155.2（s，C-9），103.1（s，C-10），121.7（s，C-1′），128.8（d，C-2′/6′），115.9（d，C-3′/5′），160.0（s，C-4′），73.8（d，C-1″），70.4（d，C-2″），78.9（d，C-3″），71.1（d，C-4″），81.9（d，C-5″），61.3（d，C-6″），75.0（d，C-1″′），69.8（d，C-2″′），73.9（d，C-3″′），68.8（d，C-4″′），70.6（d，C-5″′）。以上数据与文献[12-13]基本一致，故鉴定化合物2为夏佛塔苷（schaftoside）。

2.2.3 化合物3 化合物3为淡黄色无定形粉末，UV在波长270、335 nm处有最大吸收，HR-ESI-MS显示m/z为563.141 1[M-H]-（计算值563.140 6），推测化合物的分子式为C26H28O14，可能为化合物2的同分异构体。1HNMR（DMSO-d6，600 MHz）δH：14.04（1H，s，加D2O后消失，5-OH），10.29（1H，br s，加D2O后消失，7-OH），8.32（2H，d，J＝8.8 Hz，H-2′/6′），6.91（2H，d，J＝8.8 Hz，H-3′/5′），6.83（1H，s，H-3），4.76（1H，d，J＝10.0 Hz，H-1″′），4.67（1H，d，J＝9.8 Hz，H-1″）。13C-NMR（DMSO-d6，150 MHz）δC：163.9（s，C-2），102.8（d，C-3），182.4（s，C-4），159.0（s，C-5），107.7（s，C-6），161.3（s，C-7），102.8（s，C-8），154.9（s，C-9），103.7（s，C-10），121.5（s，C-1′），128.7（d，C-2′/6′），116.0（d，C-3'/5'），161.3（s，C-4′），74.0（d，C-1″），69.2（d，C-2″），78.9（d，C-3″），71.1（d，C-4″），81.2（d，C-5″），60.1（d，C-6″），74.0（d，C-1″′），70.6（d，C-2″′），78.1（d，C-3″′），70.2（d，C-4″′），81.2（d，C-5″′）。以上数据与文献[12-13]基本一致，故鉴定化合物3为异夏佛塔苷（isoschaftoside）。

2.2.4 化合物4 化合物4为淡黄色无定形粉末，UV在波长270、335 nm处有最大吸收，HR-ESI-MS显示m/z为577.157 3[M-H]-（计算值577.156 3），推测化合物的分子式为C27H30O14。二级质谱给出1组诊断离子（m/z分别为297.077 8、325.073 0、353.067 9、383.078 8），说明该化合物具有芹菜素-6，8-C-二糖苷结构[5]。碎片离子m/z473.110 6、457.115 7分别为母离子脱去1个C4H8O3和1个C4H8O4，说明结构中存在1个葡萄糖基和1个鼠李糖基[5]。1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz）δH：13.91（1H，s，加D2O后消失，5-OH），8.03（2H，d，J＝8.8 Hz，H-2′/6′），6.90（2H，d，J＝8.8 Hz，H-3′/5′），6.81（1H，s，H-3），5.05（1H，s，H-1″），4.73（1H，d，J＝9.9 Hz，H-1″′），1.26（3H，d，J＝5.2Hz，CH3-6″）。13C-NMR（DMSO-d6，150 MHz）δC：164.2（s，C-2），102.5（s，C-3），182.3（s，C-4），157.3（s，C-5），107.2（s，C-6），162.1（s，C-7），105.1（s，C-8），155.2（s，C-9），103.3（s，C-10），121.6（s，C-1′），129.1（d，C-2′/6′），116.0（d，C-3′/5′），161.3（s，C-4′），74.5（s，C-1″），72.3（d，C-2″），74.2（d，C-3″），71.8（d，C-4″），77.4（d，C-5″），18.3（d，C-6″），73.4（d，C-1″′），70.9（d，C-2″′），78.8（d，C-3″′），70.7（d，C-4″′），82.0（d，C-5″′），61.5（d，C-6″′）。以上数据与文献[14-15]的基本一致，故鉴定化合物4为异佛莱心苷（isoviolanthin）。

2.2.5 化合物5 化合物5为淡黄色无定形粉末，UV在波长270、335 nm处有最大吸收，HR-ESI-MS显示m/z为577.156 8[M-H]-（计算值577.156 3），推测化合物的分子式为C27H30O14，可能为化合物4的同分异构体。1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz）δH：13.67（1H，s，加 D2O 后消失，5-OH），7.82（2H，d，J＝8.0 Hz，H-2′/6′），6.91（各2H，d，J＝8.0 Hz，H-3′/5′），6.60（1H，s，H-3），4.77（1H，s，H-1″′），4.62（1H，d，J＝8.5 Hz，H-1″），1.14（3H，d，J＝6.0 Hz，H-6″′）。13C-NMR（DMSO-d6，150 MHz）δC：163.1（s，C-2），102.6（d，C-3），181.9（s，C-4），161.1（s，C-5），109.2（s，C-6），161.1（s，C-7），102.6（s，C-8），152.9（s，C-9），102.6（s，C-10），121.4（s，C-1′），128.4（d，C-2′/6′），116.0（d，C-3′/5′），160.1（s，C-4′），73.2（d，C-1″），70.1（d，C-2″），79.1（d，C-3″），70.8（d，C-4″），81.6（d，C-5″），61.5（d，C-6″），74.9（d，C-1″′），72.3（d，C-2″′），74.4（d，C-3″′），71.9（d，C-4″′），77.2（d，C-5″′），18.2（d，C-6″′）。以上数据与文献[14，16]基本一致，故鉴定化合物5为佛莱心苷（violanthin）。

2.3 化合物1～5的α-葡萄糖苷酶抑制活性研究

α-葡萄糖苷酶抑制活性测定实验参考文献[17]的方法。α-葡萄糖苷酶（0.1 U/mL）及其底物pNPG（1.0 mmol/L）、Na2CO3溶液（0.1 mol/L）均用PBS配制。反应在96孔板中进行：取30 μL PBS，加入5 μL DMSO、10 μL α-葡萄糖苷酶和45 μL待测样品[化合物1～5用DMSO溶解，加样时用PBS稀释；阿卡波糖（阳性对照）用超纯水溶解，加样时用PBS稀释。给药浓度均为1～500 μmol/L]，置于微孔板恒温振荡器中，于37℃条件下反应10 min；然后加入10 μL pNPG，反应15 min；加入45 μL Na2CO3溶液终止反应，混匀后，于405 nm波长下测定吸光度（A），每个待测样品设置3个平行。按下列公式计算α-葡萄糖苷酶抑制率，并用Origin软件计算半数抑制浓度（IC50）。α-葡萄糖苷酶抑制率（%）＝[1-（A样品-A背景）/（A阴性-A空白）]×100%（式中，A样品为酶、待测样品和底物反应后测得的A；A背景为上述过程只加待测样品反应后测得的A；A阴性为上述过程只加酶和底物反应后测得的A；A空白为上述过程只加PBS反应后测得的A）。结果显示，化合物1～5和阿卡波糖抑制α-葡萄糖苷酶活性的IC50分别为（1.79±1.27）、（2.05±0.72）、（1.93±0.67）、（1.09±0.46）、（1.36±0.58）、（18.69±1.24）μmol/L（n＝3）。

3 讨论

α-葡萄糖苷酶抑制剂是临床降低患者餐后血糖水平的常用药物。然而，自阿卡波糖问世以来，迄今为止只有阿卡波糖等少数几种α-葡萄糖苷酶抑制剂可用于临床，从天然药物中寻找新的α-葡萄糖苷酶抑制剂有望推动降血糖新药研发[18]。本研究以α-葡萄糖苷酶活性为引导，从铁皮石斛叶中分离得到5个芹菜素-6，8-C-二糖苷类成分，均具有显著的α-葡萄糖苷酶抑制活性，系首次报告该类成分的α-葡萄糖苷酶抑制活性。因此，芹菜素-6，8-C-二糖苷可能为铁皮石斛叶降血糖活性成分，有望作为先导化合物进行降血糖药物研究。本研究采用波谱学技术对化合物1～5的化学结构进行了解析，其中化合物1为新化合物，是首个同时具有鼠李糖和异鼠李糖取代的黄酮碳苷类成分，通过二维NMR谱和圆二色光谱确定了其立体构型，并对其波谱数据进行了详细归属；化合物2首次从该植物中分离得到。