正交实验法提取茶叶中咖啡因的工艺研究

王船英，桑 蕾，邾枝花，许玉芳

(安徽医学高等专科学校，安徽 合肥 230601)

咖啡因(1,3,7-三甲基-2,6-二氧嘌呤)为白色粉末或白色针尖状晶体，易溶于热水、乙醇、三氯甲烷，熔点为234～238℃，178℃时升华。咖啡因是一种生物碱，广泛存在于咖啡豆、可可和茶叶中。咖啡因是一种重要的医药原料，可以消除疲劳，减弱酒精、吗啡、烟碱等物质的毒害，促进血液循环，预防高血压和心肌梗塞，具有抗氧化、抗衰老等作用[1-3]，临床上用于治疗神经衰弱、偏头痛等疾病[4]。

从茶叶中提取咖啡因的提取方法包括水提法、有机溶剂提取法、超声辅助提取法、超临界CO2提取法等。这些提取方法各有优缺点。水提法溶剂成本低、绿色环保、但浓缩时间长、提取率低。有机溶剂提取法，通常以甲醇、乙醇、丙酮或三氯甲烷作为溶剂提取咖啡因。乙醇作为提取溶剂，其提取率高，且浓缩蒸馏出来的乙醇可以回收使用，绿色、安全。甲醇、丙酮、三氯甲烷这些有机溶剂易挥发，毒性大，考虑到绿色环保、安全的原则，一般不会使用这些有机溶剂。直接升华法、超声辅助法和超临界CO2提取法，提取率高，节能环保，但在学生实验中运用不多[5]。现结合实验室条件和其他各方面因素，综合考虑，选择以乙醇为提取剂进行提取实验，首先进行单因素考察，再根据单因素考察的结果设计正交实验，优化提取工艺。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

市售绿茶、红茶、白茶。

乙醇(分析纯)、氧化钙(分析纯)、沸石、咖啡因对照品(购于成都麦德生科技有限公司)、甲醇(色谱纯)、纯化水。

索氏提取器、蛇形冷凝管、蒸馏装置、电加热套、酒精灯、漏斗、蒸发皿、玻璃棒、滤纸、纱布袋、0.45 μm有机滤膜、电子天平(上海越平)、高效液相色谱仪(Waters 1525-2489)、色谱柱(C18，5 μm×4.6 mm×250 mm，大连依利特公司)、显微熔点测定仪(北京科学仪器有限公司，XT4B型)。

1.2 实验方法

取适量茶叶置于研钵中，研磨成粉末。称取10 g碎茶叶末置于滤纸套筒中，以乙醇为提取剂，用索氏提取装置连续提取60 min，然后蒸馏，浓缩提取液，倒入蒸发皿中，加入氧化钙后进行焙炒至干。用扎好小孔的滤纸扣在蒸发皿上，倒扣上玻璃漏斗，漏斗颈处放一团脱脂棉，酒精灯加热，升华至有棕色烟雾产生，得咖啡因晶体。称量后计算咖啡因产量。

2 结果分析

2.1 单因素设计

2.1.1 茶叶种类

茶叶的种类有很多，常见的有绿茶、红茶、白茶等。本实验选用市售绿茶、红茶、白茶。按1.2实验方法，分别称取10 g绿茶、红茶、白茶，平行进行3次实验，以95%乙醇为提取剂，连续提取60 min，升华时间5 min。升华出咖啡因晶体质量如表1所示。通过实验数据可以看出，其他实验条件相同时，从红茶中提取出的咖啡因质量高于绿茶，白茶中咖啡因产量最低。

2.1.2 乙醇体积分数

咖啡因易溶于乙醇，故选取乙醇为提取剂。称取10 g绿茶，按1.2实验方法，分别采用75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇为提取剂各平行实验3次，提取时间60 min，升华时间5 min。最终得到咖啡因晶体质量如表2所示。可以看出，三种体积分数的乙醇提取出的咖啡因晶体质量差别较大，其中95%乙醇作为提取剂，提取出的晶体质量最大。

表2 不同浓度乙醇提取出咖啡因晶体的质量

2.1.3 提取时间

按1.2实验方法，称取10 g绿茶，以95%乙醇为提取剂，分别提取60 min、90 min、120 min、150 min，平行实验3次，每次升华时间5 min。得到咖啡因晶体质量见表3。可以看出，提取时间对咖啡因产率影响较大，提取时间越长，咖啡因产率越高。提取150 min的咖啡因产量最高，相较于提取120 min的产量，增幅不明显。

表3 不同提取时间提取出晶体的质量

2.1.4 茶叶包材质

按1.2实验方法，取绿茶10 g，分别置于无纺布袋中、滤纸套筒中和纱布袋中，以95%乙醇为提取剂，连续提取60 min，平行实验3次。考察茶叶包材质对实验结果的影响。通过表4中实验结果可以看出，几次实验后，咖啡因产量差别不大。因此，可以判定茶叶包材质对咖啡因产量影响不大，该因素可以忽略。

表4 不同茶叶包材质提取出晶体的质量

2.1.5 升华时间

称取绿茶10 g，置于滤纸套筒中，以95%乙醇为提取剂，连续提取60 min后浓缩，加入氧化钙后焙炒至干燥。干燥粉状物分别升华5 min、8 min、10 min、12 min，得到咖啡因质量如表5所示。通过该实验可以看出，升华时间对晶体的质量有影响，升华10 min，咖啡因质量最高，升华12 min时咖啡因质量略有下降。

表5 不同升华时间提取出晶体的质量

2.2 正交实验设计

2.2.1 正交实验影响因素确立及水平的选择

通过单因素各项考察结果可以看出，茶叶种类A、乙醇体积分数B、提取时间C、升华时间D对茶叶中咖啡因提取的影响较大，选取这4个因素为考察因素，以咖啡因晶体质量为评价指标，设计L9(34)4因素3水平正交实验，优化茶叶中提取咖啡因的工艺。影响因素及水平见表6。

表6 因素水平一览表

2.2.2 正交实验结果

表7中R为各因素的极差，反映了各因素影响实验结果的主次关系。R越大，说明该因素对实验指标的影响越大，该因素也就越重要[6]。由极差分析结果可以看出，4个因素对咖啡因提取产量的影响大小程度依次为A>C>B>D。从表7可得出，正交实验范围内的较优的提取条件为A2C3B3D3，即选取红茶为原料，提取剂为95%乙醇，提取120 min，升华时间10 min，咖啡因产量最高。

表7 正交实验结果

2.3 样品熔点测定

提取出的晶体外观为白色针尖状，如图1所示。取适量晶体，利用熔点测定仪对其熔点进行测定，测得该晶体样品熔点为234.5℃，与《中华人民共和国药典》中对于咖啡因的熔点记录相符[7]。该样品熔程短，纯度高。

图1 咖啡因晶体

2.4 高效液相色谱分析

将咖啡因对照品和提取出的咖啡因样品，分别精密称取5 mg，用甲醇将其溶解、定容至50 mL容量瓶中，配制成0.1 mg/mL的溶液。分别取5 mL对照品溶液和样品溶液，经0.45μm的有机滤膜滤过，备用。再取滤过溶液分别进行高效液相色谱分析。色谱条件：流动相为甲醇 ∶纯化水(体积比40 ∶60)；流速为1 mL/min；检测波长为 271 nm；进样量20 μL。图2为咖啡因对照品液相色谱图，图3为实验提取出的咖啡因样品液相色谱图。样品溶液与咖啡因对照品溶液出峰保留时间相同，可以确定该样品为咖啡因。

图2 咖啡因对照品HPLC图谱

图3 提取出的咖啡因样品HPLC图谱

3 结论

以普通市售茶叶为原料，采用索氏提取器连续提取，利用正交实验方法，得出了最优的工艺条件：选用红茶为原料，用95%乙醇作提取剂，连续提取120 min，提取液经蒸馏浓缩后焙炒至干，升华10 min，平行实验3次，获取升华出的咖啡因晶体分别为76.49 mg、75.18 mg、79.22 mg，平均产量为76.96 mg。3次实验提取率高且具有重复性，说明该工艺条件合理、优越。