基于斑马鱼模型研究不同磷脂促血管生成活性

解冬晓，李昊楠，孟荣华，李培海，张梦启，翟宏斌，刘可春，马耀宏，李晓彬,*

（1.齐鲁工业大学（山东省科学院）生物研究所，山东 济南 250103；2.邹城市疾病预防控制中心，山东 济宁 273500；3.北京大学深圳研究生院，广东 深圳 518000）

血管生成是在原有血管基础上生成新血管的过程，此过程受多种诱导因子和抑制因子的相互作用，从而维持机体处于正常生理健康状态。当血管生成不足时，会引起神经缺损、高血压、脑缺血性中风、骨质疏松、闭塞性血管炎、糖尿病性周围血管病变和心肌梗死等一系列相关疾病。寻找具有促进血管生成作用的药物是治疗上述缺血性疾病的重要策略，也是当今临床研究的热点。

血管生成药物的发现需要借助血管生成模型，常见的血管生成模型包括体外模型（内皮细胞模型和大鼠动脉环模型）、体内模型（角膜微囊、鸡胚绒毛尿囊膜、圆盘血管生成模型和海绵-基质胶模型等）和整体动物模型（斑马鱼模型和爪蟾蝌蚪模型）。其中，斑马鱼模型具有体型小、产卵多、发育周期短、胚胎透明等优点，兼具细胞模型的高通量性和动物模型的高内涵性，与人类基因组的同源性高达87%。斑马鱼符合“3R”原则（reduction, replacement, refinement）（减少、替代、优化），被欧洲替代法验证中心推荐为新的模式动物，也已被美国食品药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）和欧洲药物评审组织（The European Agency for the Evaluation of Medicinal Products，EMEA）接受用于进行药理学评价申报临床试验，因此斑马鱼作为药物筛选模式动物已得到国际公认。斑马鱼为体外发育、胚胎透明，同时通过转基因绿色荧光标记血管使得能够在活体胚胎中直观而快捷地观察样品对其血管系统的影响。目前，作为药物筛选模型，斑马鱼已越来越多的被研究团队用于血管功能分子的筛选与评价。本研究利用斑马鱼模型，评价各磷脂样品对Vatalanib（PTK787）诱导损伤的斑马鱼体节间血管（intersegmental vessel，ISV）和肠下静脉血管（subintestinal vein vessel，SIV）生长情况的影响，综合评估和比较不同磷脂的促血管生成活性。

磷脂广泛存在于生物体内，是各种生物膜的重要组成部分，在调控机体代谢等方面起着至关重要的作用。磷脂具有丰富的生物活性和保健功能，如在预防心脑血管疾病方面，可以降血脂、促进血液循环。现有研究还发现磷脂具有保护或促进血管生成的作用，例如增加不饱和脂肪酸的摄入可以改善临床病理性血管生成减弱的现象，溶血磷脂酰胆碱对血管平滑肌细胞具有增殖作用。本课题组前期研究也初步发现来源于虾头的磷脂对斑马鱼血管生成具有较好的促进作用，但目前鲜有研究以血管生成作为靶点系统评价磷脂的生物活性。因此，本实验选择不同来源、不同类型的磷脂，利用斑马鱼血管生成模型，综合比较磷脂成分的促血管生成活性，以期为以磷脂作为有效成分进行促血管生成类药品和保健食品、特医食品等功能性食品的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

血管荧光转基因斑马鱼Tg（∶）由山东省科学院生物研究所提供，斑马鱼饲养于斑马鱼循环水养殖系统中，温度（28.0±0.5）℃，每天重复14 h黑暗和10 h光照交替的循环，每日喂食颗粒状饵料和刚孵出的卤虫无节幼体两次。

南美白对虾虾头、鸡蛋和大豆购自当地市场；大豆磷脂软胶囊、鱼油软胶囊、卵磷脂络合碘片、多烯磷脂酰胺胆碱胶囊购自当地药店。

1-苯基-2-硫脲（1-phenyl-2-thiourea，PTU）、链酶蛋白酶Ev、Vatalanib（PTK787）、丹参素钠（salvianic acid A sodium，SAAS）、磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）、磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine，PC）、磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）、磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）、鞘磷脂（sphingomyelin，SM）美国Sigma公司；丹红注射液（10 mL/支） 山东步长制药股份有限公司；乙醇、丙酮等分析纯 山东沃恩生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

斑马鱼养殖饲养系统 北京爱生科技公司；体视荧光显微镜 德国蔡司公司；TU-1901紫外分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司；1260超高效液相色谱仪（ultra performance liquid chromatography，UPLC）美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 磷脂提取物的制备及实验用磷脂的准备

参考文献[11]的方法，以大豆、蛋黄、南美白对虾虾头为原料分别进行磷脂提取物的制备：将各原料分别粉碎、匀浆，按料液比1∶10（/）加入体积分数95%乙醇溶液，搅拌提取2 次，每次提取6 h，合并提取液，将提取液减压抽滤，用旋转蒸发仪减压浓缩后蒸干，再溶于50 mL的溶液（（质量分数1% CaCl）∶（无水乙醇）＝1∶20）中，加入溶液4 倍体积的正己烷萃取，正己烷层使用旋转蒸发仪减压浓缩；加入正己烷，配成质量浓度为0.5 g/mL的溶液，加入溶液10 倍体积的丙酮混匀，4 ℃静置24 h，离心（10 000 r/min、10 min），沉淀于真空干燥箱45 ℃干燥获得各磷脂提取物。所得大豆、蛋黄、南美白对虾磷脂提取率分别为0.15%、4.63%和0.43%（磷脂提取物质量除以原料质量得到）。采用分光光度法（钼蓝比色法）测定磷脂的质量分数，测得大豆、蛋黄、南美白对虾磷脂提取物中总磷脂质量分数分别为47.32%、83.79%和73.28%。

实验所用磷脂包括不同来源及不同类型的磷脂。不同来源的磷脂包括商用的大豆磷脂软胶囊、鱼油软胶囊、卵磷脂络合碘片、多烯磷脂酰胺胆碱胶囊，其中胶囊破碎后取内容物，药片碾碎成粉末。本实验所用磷脂提取物分别提取自大豆、蛋黄、南美白对虾虾头；不同类型磷脂包括PE、PC、PI、PS、PM 5 种磷脂标准品。

1.3.2 斑马鱼胚胎的准备

本实验选用血管荧光转基因斑马鱼Tg（∶）作为实验模型，按雌雄数量1∶2的比例取健康成熟的斑马鱼放入交配缸内，中间放置隔板。次日亮灯前抽去隔板，光照刺激使其排卵，排卵1 h后收集受精卵，并用新鲜养鱼水冲洗3 次。为避免发育过程中的色素沉着影响结果，在含胚胎的养鱼水中加入终质量分数为3%的PTU，放入28 ℃光照培养箱中控光培养，中间每24 h更换约1/3养鱼水，并及时吸出死亡胚胎。

1.3.3 促进斑马鱼ISV生成的活性评价

将1.3.2节发育至24 h的斑马鱼胚胎随机分为6 组，即空白对照组、模型组、阳性对照组和磷脂样品组（3 个剂量），置于24 孔板中，每组3 个平行孔，每孔10 枚胚胎。空白对照组加2 mL养鱼水，模型组加入2 mL含0.25 μg/mL PTK787的养鱼水，阳性对照组加2 mL含有PTK787（0.25 μg/mL）和SAAS（100 μg/mL）的养鱼水，磷脂3 个剂量组分别加入2 mL含有PTK787（终质量浓度0.25 μg/mL）和磷脂样品（终质量浓度分别为20、40、80 μg/mL）的养鱼水。将以上各组分别放入28 ℃恒温培养箱中，培养24 h。利用荧光显微镜观察斑马鱼ISV生成情况并采集其图像，采用Image Pro Plus 5.0软件测量ISV长度。

1.3.4 促进斑马鱼SIV生成的活性评价

将1.3.2节发育至72 h的斑马鱼将胚胎随机分为4 组，即空白对照组和磷脂样品组（3 个剂量），置于24 孔板中，每组3 个平行孔，每孔10 枚胚胎。空白对照组加2 mL养鱼水，3 个剂量的磷脂样品组在加入2 mL养鱼水中的同时分别加入各磷脂样品（终质量浓度分别为20、40、80 μg/mL）。28 ℃恒温培养箱培养24 h，利用荧光显微镜观察斑马鱼SIV生成情况并采集其图像，采用Image Pro Plus 5.0软件测量SIV长度。

1.4 数据处理与分析

使用GraphPad Prism 6.01软件进行数据统计与分析，结果以平均值±标准差表示，采用单因素方差分析检验进行差异显著性分析，＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同来源磷脂对斑马鱼ISV生成的影响

由图1可见，与空白对照组相比，模型组的斑马鱼ISV长度显著降低（＜0.000 1），表明PTK787显著抑制了斑马鱼的血管生成，模型制备成功。各剂量的大豆、蛋黄、南美白对虾虾头的磷脂提取物对ISV损伤的斑马鱼有明显的修复作用，南美白对虾虾头磷脂提取物的活性最强且存在浓度依赖性。与模型组相比，各剂量的卵磷脂络合碘片以及多烯磷脂酰胺胆碱胶囊均可显著促进斑马鱼ISV的生长，且促进作用随着质量浓度的增加而增强。但大豆磷脂软胶囊以及鱼油软胶囊对斑马鱼ISV生成无显著促进作用，可能是因为这两种试样中磷脂的含量较低。

图1 不同来源磷脂对斑马鱼ISV生成的影响Fig. 1 Effect of phospholipids from different sources on ISV formation of zebrafish

2.2 不同来源磷脂对斑马鱼SIV生成的影响

由图2可知，与空白对照组相比，大豆、蛋黄、南美白对虾虾头磷脂提取物各剂量组均表现出一定的促进SIV生成作用，且大豆磷脂和南美白对虾虾头磷脂提取物的活性强于其他各磷脂样品。所选4 种磷脂类市售产品对斑马鱼SIV均有不同程度的促进生长作用。多烯磷脂酰胺胆碱胶囊的促SIV生成作用存在一定的浓度依赖性，随着质量浓度的增加，促SIV生成作用明显增强，其余3 种市售产品均在中质量浓度（40 μg/mL）下促进SIV生成作用最强。

图2 不同来源磷脂对斑马鱼SIV生成的影响Fig. 2 Effect of phospholipids from different sources on SIV formation of zebrafish

2.3 不同类型磷脂对斑马鱼ISV生成的影响

由图3可知，与空白对照组相比，模型组的斑马鱼ISV长度显著降低（＜0.000 1），表明PTK787显著抑制了斑马鱼的血管生成，模型制备成功。同时，PE、PC、PS以及高质量浓度（80 μg/mL）的SM与模型组相比表现出明显的促ISV生成作用。其中PE、PC的促血管生成活性表现出相反的剂量-效应关系。在实验质量浓度范围内，随着PE质量浓度增加，ISV生成促进作用逐渐减弱，相反，PC在实验质量浓度范围内，随着给药质量浓度的增加，ISV生成促进作用逐渐增强。PS在各实验质量浓度下，ISV生成促进作用相差不大。而PI在本研究的给药质量浓度下对ISV生成没有促进作用。

图3 不同类型磷脂对斑马鱼ISV生成的影响Fig. 3 Effects of different types of phospholipids on the formation of ISV in zebrafish

2.4 不同类型磷脂对斑马鱼SIV生成的影响

由图4可知，与空白对照组相比，5 种磷脂标准品均表现出不同程度的血管生成促进作用。其中PS、SM存在一定浓度依赖性，随着PS、SM标准品质量浓度增大，对SIV生成的促进作用增强。与其他标准品相比，PI的SIV生成促进作用较为明显，这与2.3节中PI对ISV生成活性的影响结果有所不同。而对于PE，仅在高质量浓度（80 μg/mL）时表现出对SIV生成的促进作用。

图4 不同类型磷脂对斑马鱼SIV生成的影响Fig. 4 Effects of different types of phospholipids on the formation of SIV in zebrafish

3 讨 论

近几年，斑马鱼在癫痫、肝损伤、肾损伤、糖尿病等临床疾病中成功建立模型并被越来越多的学者应用，成为继小鼠后的第二优势实验动物。磷脂在临床疾病治疗、食品加工、化工等方面应用广泛，但相对于市场上主要的大豆磷脂和蛋黄磷脂产品，海产动物来源磷脂的应用研究还较少。本研究采用斑马鱼为模式动物，对来源于大豆、蛋黄和南美白对虾虾头的磷脂以及市售磷脂产品和标准品进行系统的促血管生成活性评价和比较。

前期本团队采用UPLC-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱方法对大豆、蛋黄和南美白对虾虾头3 种原料进行了脂质组学研究，并基于斑马鱼模型评估3 种原料脂质的抗炎、抗氧化和抗血栓等活性；研究表明，虾头脂质结构种类最多，高达1 764 种，且主要脂质类型是磷脂，大豆和蛋黄中主要脂质是甘油脂。3 种原料来源的脂质均表现出较强的抗氧化和抗炎活性，虾头和大豆脂质组有明显的抗血栓活性。本实验分别采用有机溶剂提取方法从上述3 种原料中制备磷脂提取物，经钼蓝比色法测定磷脂质量分数，发现蛋黄和虾头提取物中的磷脂质量分数明显高于大豆；基于斑马鱼模型进行促血管生成活性研究发现3 种提取物在一定质量浓度条件下对斑马鱼ISV和SIV均具有较明显的促血管生成活性，相对而言，南美白对虾虾头磷脂促进ISV生成的活性更强，这与前期研究中虾头磷脂在抗氧化、抗炎和抗血栓活性方面的表现相似，可能是与海洋磷脂中含有丰富的多不饱和脂肪酸侧链有关。同时本实验还探讨了不同质量浓度下4 种磷脂类产品对斑马鱼的促血管生成活性，发现在一定质量浓度条件下4 种磷脂类产品均具有促进SIV血管生成的活性，而在促ISV生成活性方面，仅有卵磷脂络合碘片和多烯磷脂酰胺胆碱胶囊具有显著的活性，这可能是另外两种磷脂类保健产品大豆磷脂软胶囊和鱼油软胶囊中磷脂含量较低，因此，有必要进一步开发高纯度的磷脂类产品以确保其更好的功效。对于5 种磷脂标准品，均在不同程度上表现出一定的血管生成促进作用。以ISV生成情况作为评价指标，PE、PC、PS以及高质量浓度（80 μg/mL）的SM表现出明显的促血管生成作用，以SIV血管生成情况作为评价指标，在一定质量浓度条件下所有磷脂标准品均表现出较明显的血管生成促进作用，表明对海洋来源磷脂进一步分离纯化以获得磷脂亚类，可能是对海洋磷脂资源精细化开发利用的一个方向。

由前期脂质组学分析以及本次活性实验结果可知，南美白对虾虾头中的磷脂含量最高，且促进血管生成活性最强。由此可见虾头磷脂在开发新型促血管生成药物方面具有巨大潜力。大豆、蛋黄等脂肪酸侧链组成相对简单，且不饱和程度较低，而海产动物来源的磷脂因侧链中富含二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸等丰富的-3多不饱和脂肪酸，在生理功能和生物活性方面具有特有的优势，但其产品化还很少，目前国际市场上能见到的主要是南极磷虾油类的保健产品，因此对于海产动物来源的磷脂开发利用前景广阔，也已引起很多研究者的关注。另外，以海产品加工副产物为原料开发和利用海洋磷脂不仅可以为人类提供更加优质的磷脂产品，还可以减少海洋资源浪费以及环境污染，增加海洋产品的附加值。

4 结 论

本研究结果显示，不同质量浓度的磷脂提取物、市售产品以及磷脂标准品对斑马鱼均具有一定的促血管生成活性，其中，南美白对虾虾头磷脂的活性强于另外两种陆地来源（大豆、蛋黄）的磷脂，推测是由于海洋磷脂因分子结构的特殊性使其生物活性具有一定的优势。本研究可为利用不同来源和种类磷脂开发促血管生成药物、保健品等提供借鉴，为缺血性疾病药物研发提供理论依据。