基于离子淌度质谱研究低浓度甘油对蛋白质结构的影响

2022-09-29何源峰朱龙平

质谱学报 2022年5期

何源峰，朱龙平，苗慧，陈宝

(中山大学药学院，广东广州 510006)

甘油是一种简单的多元醇化合物，与水混合后，具有许多生物和工业应用。甘油能在极端条件下稳定蛋白质，如热应激、冷冲击、高压等[1-4]。大多数蛋白质在纯化后通常保存在含有甘油的缓冲体系中，以保持其生物活性的稳定性[5]。目前，关于甘油对蛋白质的保护作用机制仍存在争议，大部分研究主要着眼于高浓度甘油对蛋白质结构的影响[1,5-6]，而对低浓度甘油的研究则较少。因此，深入了解低浓度甘油对蛋白质结构的影响，有利于蛋白质的相关研究和应用。

电喷雾电离质谱(ESI-MS)是研究蛋白质结构和功能的常用技术，具有可靠、省时的特点[7-8]。当ESI-MS与离子淌度(ion mobility spectrometry, IMS)相结合时，可以更详细地描述蛋白质的构象变化[9-14]。当不同尺寸、电荷和形状的离子穿过离子淌度腔室时，会根据碰撞截面积(CCS)的大小在中性介质中迁移并分离。通过测量蛋白质的分子质量、电荷态分布、漂移时间和CCS值，可以得到蛋白质的结构变化信息。

本研究以牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)为模型蛋白，采用离子淌度质谱(IM-MS)技术考察低浓度甘油对蛋白质结构的影响，并探讨其可能的机制。采用动态光散射法验证液体状态下低浓度甘油对蛋白质粒径的影响，同时利用碰撞诱导去折叠指纹图谱研究其对蛋白质稳定性的影响，以期进一步了解甘油稳定蛋白质的机制，为蛋白质的相关研究和开发提供参考。

1 实验部分

1.1 仪器与装置

Synapt G2-Si HDMS电喷雾-四极杆-行波离子淌度-飞行时间质谱仪：美国Waters公司产品；DynaPro Plate Reader II高通量动态光散射仪：美国Wyatt公司产品；P-97毛细管拉制仪：美国Sutter公司产品；5424R冷冻离心机：德国Eppendorf公司产品；MPC-P25 微孔板离心机：杭州奥盛仪器有限公司产品；XS105十万分之一天平、Delta 320 pH计：德国Mettler公司产品；Milli-Q Advantage A10超纯水机：德国Merck Millipore公司产品。

1.2 材料与试剂

马心肌红蛋白、BSA、氨水：美国Sigma公司产品；甘油：上海麦克林生化科技有限公司产品；醋酸铵、甲酸：美国Thermo Fisher公司产品；甲醇：美国Honeywell公司产品；硼硅酸毛细管：美国Sutter公司产品；96孔板：美国Corning公司产品；其余试剂均为分析纯。

1.3 实验方法

1.3.1溶液配制精密称取适量的BSA，用100 mmol/L醋酸铵溶液(pH 7.4)配制成50 μmol/L母液。取20 μL BSA母液，分别加入不同体积的10%甘油，并用100 mmol/L醋酸铵溶液稀释至50 μL，得到甘油浓度分别为0%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、2%和4%的BSA溶液(20 μmol/L)。

精密称取适量的马心肌红蛋白，用甲醇-水-甲酸溶液(49∶49∶2，V/V/V)配制成10 μmol/L的变性马心肌红蛋白溶液。

1.3.2行波离子淌度数据采集将质谱仪切换为离子淌度采集模式，打开氮气(淌度气体)、氩气(碰撞、冷却、净化离子)和氦气(缓冲作用)。吸取3 μL BSA蛋白溶液上样，优化离子淌度条件。采用已知CCS的变性马心肌红蛋白进行CCS校正，计算BSA离子的CCS。行波离子淌度的基本原理及校正程序已有报道[15-17]，主要参数如下：纳升电喷雾离子源(nESI)，正离子模式，毛细管电压0.8～1.2 kV，锥孔电压40 V，源偏移80 V，源温度37 ℃，离子淌度气体为氮气，行波速度175 m/s，行波高度8 V。通过4 V的增量将碰撞能量逐步增加到70 V，以获得碰撞诱导去折叠数据。

1.3.3动态光散射以100 mmol/L醋酸铵溶液(pH 7.4)为溶剂，配制甘油浓度分别为0%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、2%和4%的BSA溶液(1 g/L)，4 ℃下以10 000 r/min离心10 min，缓慢吸取100 μL上清液，加入96孔板中，25 ℃下以2 000 r/min离心3 min；利用高通量动态光散射仪测量各样品的流体力学半径，测量温度25 ℃，散射角150 °。

1.3.4数据处理采用Waters公司的Masslynx V4.1和Driscopt软件处理离子淌度数据，WYATT公司的DYNAMICS 7.8.1.3软件处理动态光散射数据。

2 结果与讨论

2.1 ESI-MS分析

质谱分析具有基于电荷态分布的变化跟踪蛋白质结构变化的能力[18]。电荷态分布结果显示，在不含甘油的情况下，BSA的主要电荷态为+15和+16，表明其四级结构保存完好，处于紧凑的折叠状态[19]；当甘油浓度≤0.1%时，BSA的电荷态分布与不含甘油的电荷态分布基本一致，表明结构未发生显著变化；当甘油浓度为0.5%时，BSA的电荷态分布发生显著变化，整体向高电荷态转移；随着甘油浓度的进一步增加(≤4%)，BSA的电荷态不断向高电荷态转移，低电荷态的峰基本消失，表明气相中BSA结构发生显著变化，示于图1。

图1 不同浓度甘油条件下BSA的质谱图Fig.1 Mass spectra of BSA with different concentrations of glycerol

(1)

2.2 离子淌度分析

(2)

图2 甘油浓度对BSA平均电荷的影响Fig.2 Effect of glycerol concentrations on average charge of BSA

图3 甘油浓度对BSA的CCS值的影响Fig.3 Effect of glycerol concentrations on CCS of BSA

进一步考察不同电荷态BSA离子的折叠情况，结果示于图4。携带不同电荷的BSA离子具有不同的漂移时间，其CCS值随着电荷数的增加而增大，表明BSA离子所带电荷数越多，其去折叠程度越大。

图4 2%甘油存在下不同电荷 BSA离子的碰撞截面积Fig.4 CCS of BSA ions with different charges in 2% glycerol

同一蛋白质较高电荷态的离子比较低电荷态的离子具有更大的CCS值，其原因可能是高电荷态导致库仑排斥力增加，进而使离子在气相中展开，也可能是从溶液中转移了不太紧凑的蛋白质进入质谱[20]。为了研究低浓度甘油导致蛋白质结构松散的机制，本实验分析了单电荷态蛋白质离子的CCS值与甘油浓度之间的关系。结果显示，在一定的甘油浓度范围(0.1%～4%)内，+16、+17和+18电荷态BSA离子的CCS值均随着甘油浓度的增大而增大，示于图5a；类似地，单个电荷态BSA离子的到达时间也随着甘油浓度增大而增加，示于图5b～5d。以上结果表明，甘油引起的电荷增加导致库仑排斥作用的增强不是导致蛋白质结构松散的唯一因素，甘油引起的蛋白质结构松散也可能发生在溶液中。

2.3 动态光散射

为了证明甘油引起的蛋白质结构松散是否发生在溶液中，本实验利用动态光散射法(dynamic light scattering)测量不同甘油浓度下BSA的水化半径大小，从而监测蛋白质的结构变化。结果表明，当甘油浓度≤1%时，BSA粒径未发现显著变化；当1%<甘油浓度≤4%时，BSA粒径随着甘油浓度的增大而增大，示于图6。结果表明，甘油引起的蛋白质结构松散发生在溶液中。

2.4 碰撞诱导去折叠

较高浓度的甘油(10%～40%)可提高蛋白质稳定性[1,6,21]，而低浓度甘油在引起蛋白质结构松散的情况下是否可以提高蛋白质稳定性有待进一步分析。本研究考察了在添加/不添加甘油情况下进入离子淌度腔室前对BSA离子进行碰撞激活，得到相应的碰撞诱导去折叠指纹图谱，示于图7。在相对较低的碰撞能量下，无论是否添加甘油，BSA离子的漂移时间基本一致(约13.6 ms)，表明BSA处于紧凑构象。随着碰撞能量的增加，未添加甘油的BSA在40～44 V之间发生了一个去折叠事件，产生漂移时间约15.5 ms的松散构象，48 V时紧凑构象完全消失，示于图7a；而在含0.5%甘油的情况下，BSA去折叠开始发生在更高的电压，并且去折叠过渡发生在更宽的电压范围内，44～58 V之间仍以紧凑构象为优势构象，62～70 V之间则以松散构象为优势构象，在70 V时仍可检测到紧凑构象(约30%)，示于图7b。以上结果表明，低浓度甘油仍可提高蛋白质稳定性，抑制蛋白质去折叠。这可能是由于甘油会与蛋白质发生极强的非共价相互作用[22]，从而抑制蛋白质去折叠。

图5 BSA的16+、17+、18+电荷状态的CCS值(a)和到达时间(b～d)与甘油浓度的关系Fig.5 Relationship between CCS value (a) and arrival time (b-d) of the 16+, 17+ and 18+ charge states of BSA with glycerol concentrations

图6 甘油浓度对BSA水化半径的影响Fig.6 Effect of glycerol concentration on hydration radius of BSA

3 结论

本研究采用离子淌度质谱法和动态光散射法考察了在近似生理条件下低浓度甘油(0.05%～4%)对BSA结构和稳定性的影响，并探讨可能的机制。结果表明，低浓度甘油可引起气相中蛋白质结构的松散，这是电荷增加导致库仑排斥力增强和溶液中蛋白质结构松散共同作用的结果。碰撞诱导去折叠指纹图谱表明，低浓度甘油可提高蛋白质的稳定性，这可能是甘油与蛋白质发生极强的非共价相互作用的结果。