基于离子阱质谱的离子碰撞截面积测量方法研究进展

向 玉，姜 婷，徐 伟

(北京理工大学生命学院，北京 100084)

分子的结构分析(如蛋白质的构象)对于从分子水平上理解其功能至关重要[1-2]。离子碰撞截面积(CCS)是表征分子结构的重要指标，在区分同分异构体及其构象方面具有重要价值。离子迁移谱(IMS)是目前测量离子CCS的“金标准”[3]。静态漂移时间离子迁移谱(DTIMS)[4]、行波场离子迁移谱(TWIMS)[5]、差分离子迁移谱(FAIMS)[6]、捕获离子迁移谱(TIMS)[7]、吸入离子迁移谱(AIMS)[8-9]、横向调制离子迁移谱(TMIMS)[10]以及泛音迁移谱(OMS)[11]等离子淌度谱均利用离子迁移率的差异区分离子。当实验条件已知时，IMS可以直接通过离子漂移时间或使用具有已知CCS的离子校准漂移时间测量离子碰撞截面积。离子淌度谱具有原理简单、便携性好、成本低廉等优势，广泛应用于爆炸物检测[12]、环境分析[13]、医疗临床诊断[14]、生物学[15]等领域，尤其在痕量气体的研究中作用突出[16]。随着应用范围的持续扩大，IMS不足以分析复杂样品成分，从而发展了IMS与其他系统的联用技术以提升分析能力，如离子淌度质谱(IMS-MS)[17-18]、气相色谱-离子淌度谱(GC-IMS)[19]等。

IMS-MS可同时测量待测物质量和离子碰撞截面积，能够提供互补的离子结构信息[20-23]。但在IMS实验中，离子与缓冲气体发生多次碰撞，使离子加热并导致离子构象变化。同时，由于分子结构的复杂性和动态性，尤其是生物分子，对离子结构分析技术提出了更高的要求。因此，开发测量离子CCS的新方法成为研究热点。在单一质量分析器中实现CCS的测量，使质谱仪可以同时测量分子质量与CCS，能够降低仪器的复杂度，是未来发展趋势之一。

随着高分辨傅里叶变换质谱仪的发展，测量更大质量或尺寸的离子(例如生物分子)CCS成为可能，同时开发了离子阱中离子CCS的测量方法。离子阱中对离子CCS的测量依赖于离子与缓冲气体的碰撞产生的运动衰减，因此对离子与缓冲气体分子碰撞的表征对于测量离子CCS尤为关键。

本文将首先介绍离子缓冲气体分子碰撞理论，然后对离子阱质谱仪测量离子CCS的研究进展进行讨论，并介绍根据镜像电流提取离子CCS的方法。

1 离子缓冲气体分子碰撞理论

早期研究人员尝试利用离子回旋共振(ICR)测量离子CCS时[24]，受真空系统和磁场的限制(气压约0.1 Pa，磁场小于1 T)，离子在ICR池中与缓冲气体的碰撞多为低能碰撞。低能离子-中性分子碰撞可利用Langevin碰撞模型或硬球碰撞模型对ICR池中的碰撞进行模拟。Langevin碰撞模型将离子作为无量纲的点电荷，将中性分子作为离子感应的电偶极子[25]；硬球碰撞模型适用于更大物理半径和更高速度的离子[26]。1996年，有报道提出了结合Langevin碰撞和硬球碰撞的混合碰撞模型[27]。测量离子碰撞截面积需要在高气压下实现，与傅里叶变换离子回旋共振(FT-ICR)需要在低气压下实现高分辨相互矛盾。基于此，有研究人员[28]采用更强磁场和更大尺寸的ICR池以获得更高的分辨率，这种情况下离子会获得更高的能量，而低能离子-中性分子碰撞模型将不适用，需要开发更高能量的碰撞模型，以表征高磁场大尺寸的ICR池中离子碰撞引起的离子运动特性。

Xu等[28]研究发现，在FT-ICR池中(9.4 T，ID 96 mm，40%激发半径)，m/z1 295.6离子激发后动能可达约10 400 eV。基于此，该课题组提出了高能硬球碰撞模型研究其非线性效应，发现离子相干包的回旋共振半径不同于Langevin和硬球碰撞2种模型的因离子-中性碰撞而减小。此时假设离子的CCS是常数，其反映离子的物理尺寸，同时假设单个离子-中性分子碰撞使空间相干离子包的离子去相(或碎裂)，则激发期间离子包中的离子数(N)示于式(1)：

dN=-Nnνσdt

(1)

N(t)=N0e-nνσt

(2)

式中，N0为离子包初始离子数目。由式(2)可知，高能硬球碰撞模型中镜像电流将以指数形式衰减。Langevin碰撞模型的镜像电流衰减与高能硬球碰撞模型相同，具有不同CCS的离子，频谱曲线皆为洛伦兹曲线。硬球碰撞模型具有与高能硬球碰撞模型相同的CCS，但镜像电流衰减不同，二者根据离子阈值动能(离子从离子包中去相(或碎裂)所需的动能)区分。离子-中性分子碰撞模型比较情况列于表1，不同碰撞模型的适用范围示于图1。

温度[17]、气压[29]、离子动能[28]、缓冲气体分子[30]都会影响离子碰撞截面积的大小。目前，离子阱质谱测量离子CCS主要通过离子-中性分子碰撞导致的离子运动衰减，但同时空间电荷效应和非线性场效应也会导致离子运动衰减[28, 31]，从而影响测量结果。离子运动衰减由离子-中性分子碰撞主导，是利用离子运动衰减率计算CCS的主要前提。如果不由碰撞主导离子运动衰减，利用离子运动衰减率计算CCS的结果是不准确的。

表1 离子-中性分子碰撞模型[28]Table 1 Ion-neutral molecule collision model[28]

注：a.细胞色素C；b.泛素图1 不同碰撞模型的适用范围[28]Fig.1 Scopes of application of different collision models[28]

2 FT-ICR阱中离子碰撞截面积的测量

1963年，离子回旋共振线宽开始用于测量N2+、Ar+、O2+、H+等小离子的CCS[24,32]，此时傅里叶变换并未应用于ICR池以获得频谱。在FT-ICR开发早期，Marshall等[33]发现离子-中性分子碰撞与信号瞬态衰减率有关，可以通过分析信号衰减率对离子-中性碰撞频率进行测量，但未被广泛使用。自2012年以来，使用FT-ICR测量离子CCS得到快速发展，包括直接利用频率峰宽计算(峰宽直接测量、峰宽校正、峰形拟合)、时域衰减曲线拟合以及利用希尔伯特变换或短时傅里叶变换进行时频分析。

2.1 频率峰宽分析方法

2.1.1FT-ICR峰宽直接测量 2012年，Dearden等[30, 34]基于硬球碰撞模型提出了FT-ICR峰宽直接测量(CRAFTI)法，直接通过频域质谱线宽计算离子CCS。在高磁场水平(4.7 T)下测量FT-ICR电池中冠醚离子的CCS，计算公式如下：

(3)

(4)

式(4)表明，碰撞概率等于πfwhm，发生单次离子-中性分子碰撞的概率不直接取决于质量，而是取决于离子速度、碰撞截面和中性碰撞气体数密度。根据质谱线宽计算离子CCS需要准确的工作气压数值，但在FT-ICR实际工作中很难获得，同时单次碰撞退相干限制了检测离子质荷比的上限。因此，Dearden团队在原有基础上开发了一种“Multi-CRAFTI”技术[36]，可同时测量2个或多个离子的相对CCS，利用内部标准确定绝对CCS，并实现了四烷基胺和四辛基胺离子的CCS测量。

2.1.2峰宽校正 在FT-ICR仪器的典型操作缓冲气体压力(约10-8Pa)下，镜像电流缓慢衰减，因此在采集和记录镜像电流信号时会产生窗口效应，导致质量峰变宽，示于图2。基于此，Xu等[37]提出了一种峰宽校正方法来消除这种窗口效应，应用高能硬球碰撞模型[28]，由吸收谱线形求解离子碰撞截面积：

(5)

注：a,b分别为无限长的时域信号及其频谱；c,d分别为由6 s截断窗口加权的相同时域信号及其频谱图2 窗口效应[37]Fig.2 Windowing effect[37]

(6)

实验表明，该CCS与IMS确定的CCS线性相关，且同IMS测量差异不大，说明本方法是分析离子结构的补充，能够准确测量离子CCS。

2.1.3峰形拟合 峰宽计算对信噪比(S/N)和频率分辨能力敏感，会影响离子CCS测量的准确性和分辨能力。虽然提出了峰宽校正方法[37]，但对CCS测量的分辨率和准确性仍需进一步提高。因此，Xu等[38]提出了峰形拟合方法，利用质谱峰的频率信息重建频谱峰，准确计算离子CCS，同时提高对数据长度和背景噪声的容忍度。

同峰宽校正方法[37]一样，FT-ICR由于有限的电流信号采集时间被截断产生窗口效应。因此，峰形拟合方法中对时域镜像电流信号进行傅里叶变换，得到连续幅度谱(C(ω-ω0))：

(7)

式中，c为电流衰减因子，T为信号数据长度(时间)，ω0为离子回旋频率。

实际操作中，首先对采样的瞬态数据进行零填充，然后进行快速傅里叶变换(FFT)获得式(7)的幅度谱，流程示意图示于图3。计算特定峰的离子CCS时，确定中心峰(最大幅度值)，提取幅度大于该最大值20%的数据，利用式(7)计算理论峰形，然后通过最小二乘法拟合理论峰形与实验峰形，计算得出电流衰减因子c。基于高能硬球碰撞模型可得出目标离子CCS，通过对血管紧张素Ⅰ、缓激肽、泛素和细胞色素C的CCS测量，发现峰形拟合方法较峰宽校正方法的分辨率进一步提高。

2.2 时域信号包络提取

将电流信号转换至频域后，依据质谱峰提取离子结构信息的方法比较简单，但是由于在频域上的异构体具有相同的质谱峰，无法利用频域上的质谱峰数据直接解析异构体。因此，Xu等[39]考虑直接分析时域信号，理论上，在存在异构体的情况下，电流信号是异构体的离子运动衰减总和，据此可以解析异构体各自的离子运动衰减曲线，从而提出了基于时域的数据处理方法，提取出具有特定运动频率的离子运动衰减曲线。与在高能硬球碰撞模型中建立的直接拟合方法相比[28]，该方法能在短时间内处理大量数据。数据采集和处理的流程示意图示于图4a。

图3 峰形拟合方法流程示意图[38]Fig.3 Schematic diagram of peak shape fitting method[38]

注：a.衰减曲线拟合流程示意图；b.泛素离子电流信号提取的衰减曲线与指数拟合； c.与IMS测得的泛素离子CCS的线性相关性图4 基于时域的衰减曲线拟合方法测量离子CCS[39]Fig.4 Time-domain based decay curve fitting method of ion CCS measurement[39]

利用衰减因子c可以计算得出离子CCS：

(8)

式中，B为磁场强度，r为离子回旋轨道半径。使用FT-ICR(9.4 T)测量泛素离子，获得镜像电流信号，数据处理后提取的衰减曲线与理论指数衰减模型吻合良好，示于图4b。通过衰减曲线拟合方法测得的给定电荷状态的泛素离子CCS与IMS测量得到的CCS呈良好的线性相关性，示于图4c。

2.3 时频分析

2.3.1希尔伯特变换 Xu等[39]提出的衰减曲线拟合方法在时域直接分析电流信号时有效避免了因使用快速傅里叶变换带来的窗口效应，以及窗口效应带来的离子运动频率偏移[40-41]，但数据计算量巨大。为缩短时域分析数据长度，减少计算量，Xu等[41]开发了利用希尔伯特变换测量离子CCS的方法，直接在时域上对离子瞬态数据进行时频分析，同时提取瞬时离子运动频率、捕获离子振幅衰减曲线，利用衰减曲线计算CCS，流程示意图示于图5。

根据衰减曲线Ai(t)最小二乘法拟合高能硬球碰撞模型可以得出衰减因子c，与衰减曲线拟合相似，利用式(8)计算得出离子CCS。

图5 希尔伯特变换法流程示意图[41]Fig.5 Schematic diagram of the Hilbert transform method[41]

2.3.2短时傅里叶变换(STFT) 通常来说，复杂化合物中多种离子的CCS不能直接进行测量，同时也无法通过多次利用混合物质谱图中不同离子质谱峰数据进行测量，因此，如何同时测量复杂化合物中多种离子CCS受到关注。Shi课题组[42]开发了快速测量混合物离子CCS的方法，利用短时傅里叶变换(STFT)处理时域信号，仅1次测量即可获得多种离子CCS。时域信号经短时傅里叶变换处理后，在传统的傅里叶变换结果上增加了时间维度的信息，即获得了“时间×频率×强度”3维谱图。根据不同质荷比的离子具有不同的运动频率，可以很容易地提取混合物中每个离子的衰减曲线。根据衰减曲线与离子-中性分子碰撞模型(此时应用硬球碰撞模型，衰减曲线列于表1)拟合，可获得每个离子的CCS，成功测量了石油瓦斯油基质中脂肪酸和聚丙氨酸的CCS，示于式(9)：

(9)

其中，D为衰减因子，r0为离子初始运动半径。

近十年来，FT-ICR测量离子CCS取得了较大进展，但分辨率有待提高。除离子-中性分子碰撞外，引起离子运动衰减的其他因素(如空间电荷效应等)有待进一步解决。

3 Orbitrap轨道阱中离子碰撞截面积的测量

Orbitrap轨道阱具有与FT-ICR相媲美的分辨率和准确度，在组学研究中得到了广泛应用[43-44]。Thermo公司的Makarov等[45]研究发现，实验中测量到电流信号衰减的原因主要是由于离子与缓冲气体的大量碰撞，使离子碎裂从离子包退相干，从而提出利用Orbitrap轨道离子阱检测的信号衰减计算离子相对碰撞截面积的可能。此后，该课题组[46]利用不同离子在轨道阱中的动能不同提取目标峰的衰减因子，采用类似衰减曲线拟合的方法，利用衰减因子计算离子CCS。离子在Orbitrap中具有高动能，离子-中性分子碰撞与离子速度无关，由高能硬球碰撞模型[28]表征。随后，德克萨斯大学的Brodbelt实验室[47]进一步完善了基于Orbitrap质量分析器的时域瞬态信号衰减率确定蛋白质离子CCS的方法，建立了Orbitrap分析器中的压力与瞬态衰减率之间的线性关系，根据信号衰减率、离子速度、缓冲气体密度计算离子CCS：

(10)

其中，L是平均离子运动半径，fz是离子运动频率。利用此方法测量泛素、细胞色素C、肌红蛋白离子CCS，并与IMS测量的CCS值进行比较，发现2种方法的结果差异不大。

4 四极离子阱中离子碰撞截面积的测量

除了FT-ICR和Orbitrap，离子碰撞截面积的测量也可以在四极离子阱内实施。离子在四极离子阱中的动能远小于在FT-ICR或Orbitrap中，通常为几十eV；四极离子阱中离子受偶极激发后在径向以正弦曲线形式运动，不同于FT-ICR或Orbitrap中的圆周运动。Xu等[48]通过仿真模拟发现，四极离子阱中可能同时存在Langevin碰撞和硬球碰撞，因此混合碰撞模型更适于表征。在混合碰撞模型的基础上，Xu等[49]在离子阱中引入高阶场用于测量离子CCS。相同质荷比、不同CCS的离子运动幅度衰减速度不同，物理尺寸更大的离子衰减速度更快。引入高阶电场(如八阶场)后，离子运动频率随运动幅度的降低发生频移，利用短时傅里叶变换时频分析离子轨迹，从而获得离子运动频率随时间变化的曲线。在存在八阶场的情况下，离子运动频率f与离子有效半径r0的关系示于式(11)：

f=

(11)

图6 理论CCS与IMS测量结果[49]Fig.6 Results of theoretical CCS and IMS measurement

Xu等[49-50]提出的在离子阱测量离子CCS的方法仅在理论仿真中尝试，并未用于实际实验。最近，Nie课题组[51]利用自主搭建的四极离子阱(QIT)微粒质谱仪开发了测量粒子CCS的方法，该方法基于流动气体引起的粒子阻力和电场引起的俘获力之间的平衡，实现了对SiO2/聚吡咯核壳粒子CCS的测量。随后，Ouyang课题组[52]在自主搭建的双线性离子阱(Daul-LIT)质谱仪基础上，使用离散大气压接口在Daul-LIT之间引入动态气流，实现了LIT之间的离子转移和具有不同CCS离子的分离及测量。

目前，关于四极离子阱测量离子CCS的研究报道不多，有待进一步研究，如将引入高阶场测量离子CCS的理论方法应用于四极离子阱质谱仪等。

5 静电线性离子阱中离子碰撞截面积的测量

(12)

式中，f0为离子长期频率。

Williams实验室[54]将电荷检测质谱仪(CDMS)用于CCS测量，通过使用相似质量和已知截面的离子校准能量损失来确定离子的碰撞截面，利用离子运动频率变化与离子能量损失的联系测量离子与缓冲气体碰撞造成的能量损失，成功测量了与牛血蛋白具有相似质量的离子CCS。

以上研究证明了在ELIT中实现CCS测量的可能性，但离子CCS测量也会依赖于能量损失等其他条件。

6 不同离子阱质谱测量离子碰撞截面积的比较

基于离子阱质谱测量离子碰撞截面积的方法比较列于表2。多数离子阱质谱仪中离子与缓冲气体碰撞的概率较低，即使发生碰撞，受主要影响的为离子包，离子本身的构象基本不变，因此可同时实现离子的MS/MS反应和离子CCS测量。但目前发展的测量方法不足以满足测量需求，离子阱质谱无法同时实现多个离子CCS的测量，且无法测量同分异构体的CCS，测量方法基本建立在相对测量的前提下，得到的结果需要校准，而且受气压影响较大。

表2 基于离子阱质谱测量离子碰撞截面积方法的比较Table 2 Comparison of CCS measurement methods based on ion trap mass spectrometry

7 总结与展望

近年来，通过质谱实现离子CCS测量发展迅速，利用FT-ICR质谱仪发展了CARFTI、峰宽校正、峰形拟合等频域方法，以及时域的衰减曲线拟合方法、利用希尔伯特变换和短时傅里叶变换进行时频分析的方法，实现了更大质量离子CCS的测量。同时，开发了在Orbitrap、ELIT、QIT中测量离子CCS的方法，满足了日益增长的分子结构解析需求，逐渐成为测量CCS的重要方法。但目前CCS的测量分辨率仍需提高；空间电荷效应、非线性场效应等因素对离子运动衰减的影响仍需改善；检测器等硬件设备的工作性能仍需提高。