芪黄汤对免疫性血小板减少症小鼠作用机制研究

周 林， 禹 红， 万 敏， 刘毓玲， 段 波， 王进军

武汉市中医医院 1.检验科；2.风湿血液病科，湖北 武汉 430050

免疫性血小板减少症(immune thrombopenia，ITP)是以皮肤黏膜出血、外周血小板水平降低等为临床表现的一种自身免疫性疾病[1]，其发病机制主要与血小板自身抗原免疫耐受性缺失有关。自身抗原免疫耐受缺失使体液免疫和细胞免疫被异常激活，导致血小板生成不足及破坏加速[2]。ITP治疗的目的在于使血小板计数(platelet count，PLT)维持在安全水平内，控制出血，阻止血小板过度破坏并促进血小板生成[3]。芪黄汤是武汉市中医医院万远铁教授的临床经验方，此方经多年实践证明具有显著治疗ITP的临床疗效。本研究旨在探讨芪黄汤对ITP模型小鼠的作用机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级Balb/C小鼠90只，雌雄各半，体质量18～22 g，7～8周龄，由武汉华联科生物技术有限公司提供，使用许可证号：SYXK(鄂)2018-0104。豚鼠25只，雌性，体质量240～260 g，12周龄，由兴平市天瑞实验动物养殖场提供，使用许可证号：SYXK(鄂)2017-0065。

1.2 试剂与仪器 芪黄汤：生地黄15 g，熟地黄15 g，枸杞子15 g，山萸肉12 g，菟丝子15 g，女贞子15 g，旱莲草15 g，黄芪15 g，太子参15 g，茯苓15 g，蔻仁12 g，山药18 g(由武汉市中医医院药学部提供)，水煮浓缩至2 g/ml。醋酸泼尼松片由山东鲁抗医药集团赛特有限公司生产，国药准字：H20033023，生产批号：190713。用生理盐水将泼尼松粉末配置成混悬液(浓度为0.72 g/L)，置于4℃冰箱冷藏备用。磷酸盐缓冲液(货号P4417)、不完全弗氏佐剂(FICA，货号F5506)、完全弗氏佐剂(FCA，货号F5881)购自Sigma公司；FITC anti-mouse CD4(货号102348)、FITC anti-mouse CD8a(货号101428)、PE anti-mouse CD279(PD-1，货号135206)、PE anti-mouse CD274(PD-L1，货号102298)购自Biolegend公司。HEMAVET 950FS动物血液分析仪(美国Drew)；FACS Calibur流式细胞仪(美国BD)。

1.3 研究方法

1.3.1 豚鼠抗小鼠血小板血清制备 取10只Balb/C小鼠，麻醉后提取抗凝全血，阶梯式离心获取血小板(分别以1 000 r/min、3 000 r/min离心10 min，半径为6 cm)，用磷酸盐缓冲液调整浓度为2.5×106个/ml，分别与等量的FCA和FICA混合作为抗原，于造模第0周注射含FCA抗原1 ml，注射于豚鼠的足掌、背部、腹部皮下等至少6点，每点100 μl；于第1、2、4周注射含FICA抗原，方法同上。第5周取豚鼠心脏未抗凝全血，离心后分离血清，得到豚鼠抗小鼠血小板血清(GP-APS)，-20℃冷冻保存备用。使用前制备Balb/C小鼠5%红细胞悬液吸附2次，检验抗体效价，稀释成最佳浓度待用。

1.3.2 实验分组 取剩余Balb/C小鼠80只，适应性喂养1周后，按随机数字表法将小鼠分为正常组、模型组、泼尼松组、芪黄汤组，每组各20只。模型组、泼尼松组、芪黄汤组均用GP-APS建立ITP模型。具体方法：正常组以100 μl/20 g生理盐水进行腹腔注射，模型组、泼尼松组、芪黄汤组以100 μl/20 g的GP-APS进行腹腔注射，隔日1次，共8次。PLT在原始水平的11%～25%提示ITP动物模型造模成功[4]。造模成功第5天开始灌胃给药，正常组、模型组用生理盐水0.2 ml灌胃；泼尼松组用生理盐水制成的泼尼松混悬液0.2 ml灌胃；芪黄汤组用芪黄汤0.2 ml灌胃。每组均1次/d，连续灌胃10 d。

1.4 观察指标 眼球摘除法取血，EDTA-Na2抗凝管、动物血液分析仪检测小鼠PLT，流式细胞仪检测外周血T淋巴细胞CD4+、CD8+、CD4+PD-1+、CD8+PD-1+、CD4+PD-L1+、CD8+PD-L1+表达。处死小鼠，快速剥离股骨，用6号针头以1 ml生理盐水冲出骨髓，置于EDTA-Na2抗凝管内，制成骨髓细胞悬液，采用动物血液分析仪检测骨髓有核细胞数量[5]。剖腹取脾，称重。

脾指数=脾重/体质量

2 结果

2.1 各组PLT、骨髓有核细胞、脾指数比较 与正常组比较，模型组、芪黄汤组、泼尼松组的PLT、骨髓有核细胞降低，脾指数升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，芪黄汤组、泼尼松组的PLT、骨髓有核细胞升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组PLT、骨髓有核细胞、脾指数比较

2.2 各组外周血淋巴细胞亚群表达比较 与正常组比较，模型组小鼠外周血CD8+、CD4+PD-1+、CD4+PD-L1+表达升高，CD4+表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，波尼松组、芪黄汤组小鼠外周血CD8+、CD4+PD-1+、CD4+PD-L1+表达降低，CD4+表达升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组外周血淋巴细胞亚群表达比较

3 讨论

ITP是一种自身免疫性血液病，可能的发病机制包括机体免疫耐受失衡，细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)介导的血小板破坏，骨髓巨核细胞发育成熟障碍，以及血小板生成减少[5-6]。免疫反应包括抗原提呈细胞、T细胞和B细胞间的相互作用，自身反应性T细胞对血小板自身抗原缺失耐受，通过T细胞受体识别血小板抗原。活化的T细胞不仅激活B细胞导致自身抗体产生，还促进细胞因子的生成和CTL的活化。PD-1(CD279)是一种Ⅰ型跨膜蛋白受体，属于免疫球蛋白CD28家族，在多种免疫细胞中表达，对维持淋巴细胞稳态起关键作用；PD-1的配体PD-L1(CD274)是Ⅰ型跨膜蛋白受体B7家族的成员，广泛表达于T细胞、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞、间充质干细胞、骨髓来源的肥大细胞和一些非造血细胞[7-8]。PD-1/PD-L1在T细胞成熟、分化和增殖过程中能够提供负性共刺激信号，在机体免疫功能异常亢进时代偿性分泌增多，参与多种自身免疫性疾病的发生发展[9-10]。

中医认为，ITP归属于“血证”“紫斑”等范畴，将其命名为“紫癜病”，多由外感及内伤所致，外感风热毒邪等因素，因实致虚，内伤则为脾不统血，气不摄血，致脏腑气血亏虚，两者共同导致血不循经，血溢脉外，出现紫斑，因此应以益气养血、健脾补肾为治疗原则。芪黄汤中，生地黄清热凉血，养阴生津；熟地黄养血滋阴，益精填髓；枸杞平补肝肾、滋补强壮；山萸肉滋肝补肾、益气血；菟丝子为补肾、肝、脾之良药；女贞子养阴益肾，补气舒肝；旱莲草补益肝肾，凉血止血；黄芪补气健脾，太子参补益脾肺，益气生津，配伍黄芪，补益之效大增；茯苓、蔻仁、山药可健脾和胃，全方共奏益气养血，健脾补肾之效[11]。现代药理研究发现，地黄含有糖类、氨基酸、苯乙醇苷类等多种成分，具有抗衰老、抗氧化、增强免疫力等作用。地黄多糖能够诱导脾淋巴细胞增殖，调节T淋巴细胞，发挥免疫调节作用，还能够抑制免疫抑制模型小鼠单核细胞吞噬功能，提高PLT[12]。黄芪有增强机体免疫、抗应激、降压等作用，其主要成分黄芪多糖可提高T淋巴细胞，促进淋巴细胞转化，增强机体对干扰素的诱生，具有双向调节免疫功能的作用[13]。黄芪和生地黄配伍，清热凉血、益气扶正，可抑制体液免疫亢进，调节T细胞亚群失衡，纠正免疫紊乱[14]。

本研究发现，与正常组比较，模型组小鼠外周血CD8+表达升高，CD4+表达降低，提示ITP小鼠外周血CD8+T细胞活性更高。CD4+T细胞免疫调节方式主要通过调节细胞对抗原的反应及分泌相关细胞因子实现；而ITP患者中的CD8+T细胞在体外可以直接破坏血小板，经治疗后缓解的ITP患者CD8+T细胞在体外破坏血小板的能力则明显下降[15]。有研究发现，某些自身免疫疾病的外周血CD4+T淋巴细胞表面PD-1升高，且与疾病的活动度可能相关[16]。此外，新发ITP患者CD4+T淋巴细胞表面PD-1升高，且PD-1/PD-L1升高与ITP患者疾病活动程度有一定关系[17]。本研究结果显示，模型组小鼠外周血CD4+PD-1+、CD4+PD-L1+均较正常组升高，而CD8+PD-1+、CD8+PD-L1+与正常组无差异，提示异常的CD4+T细胞PD-1/PD-L1负性刺激通路可能参与ITP的发病过程，是自身免疫系统的一种保护机制，发挥免疫抑制反应作用。

自身反应性T细胞通过T细胞受体识别血小板抗原并被激活，不仅可以上调活化T细胞的PD-1+表达，还可以促进Th1炎性细胞因子的分泌，从而进一步提高活化T细胞上PD-1+的表达[18]。本研究中，正常组T细胞因不能识别血小板抗原而被激活，CD4+T细胞上的PD-1+、 PD-L1+表达较模型组明显呈现低水平状态，保持机体正常的免疫功能；芪黄汤组和泼尼松组PLT、骨髓有核细胞高于模型组，而脾指数无明显差异，提示芪黄汤和泼尼松具有同样良好的治疗效果，但均不能控制脾增大；芪黄汤组小鼠外周血CD4+、CD8+、CD4+PD-1+、CD4+PD-L1+表达低于模型组，提示芪黄汤可能通过调节CD4+、CD8+T淋巴细胞降低机体细胞免疫功能亢进，CD4+PD-1+、CD4+PD-L1+表达降低提示负性调节的自身保护机制也趋于平衡，最终达到免疫平衡，进而改善病情。

综上所述，芪黄汤可显著提高ITP模型小鼠PLT、骨髓有核细胞数，其机制可能与降低CD4+、CD8+T淋巴细胞表达，抑制T细胞活化和增殖，调节CD4+PD-1+、CD4+PD-L1+表达平衡有关。