基于网络药理学的银杏叶提取物防治老年性聋的作用机制研究＊

王青玲，张梦娴，郭向东

（1. 河南中医药大学第一临床医学院 郑州 450046；2. 河南中医药大学第一附属医院 郑州 450000）

1 引言

老年性聋（Age-related hearing loss，AHL）是指随年龄的增长出现的双耳、对称性、以高频听力减退为主的感音神经性耳聋。老年性聋逐渐成为世界第三大公共卫生问题，易导致抑郁、跌倒、痴呆和认知障碍等疾病，给社会带来沉重负担[1]。截止2018 年，我国65岁及以上人口约占全国总人数的11.9%[2]，该人群中老年性聋的发病率高达70%-80%，且发病率逐年攀升[2]。老年性聋的病理变化主要与耳蜗螺旋神经节细胞及其纤维、基底膜上的毛细胞等发生退行性变有关[3]，其发病机制与氧化应激及细胞凋亡等息息相关。衰老使耳蜗细胞抗氧化能力减弱，毛细胞大量丢失，螺旋神经节细胞超微结构破坏、线粒体功能障碍，进而产生氧化应激反应和细胞凋亡[4]。老年性聋的治疗手段极其有限，目前国内外临床上常用的药物包括糖皮质激素、阿司匹林、葛根素、耳聋左慈丸等，但长期使用上述药物可能会产生不良反应，临床疗效也存在争议[5]。因此，寻求一种具有抗氧化和抗凋亡作用的药物可能是防治老年性聋的一种有效方法。

银杏叶提取物（ginkgo biloba extract,GBE）是从银杏的干燥叶中提取的有效成分，含有黄酮类、懈皮素、萜类内酯等多种抗氧化和神经保护成分[6]，已被广泛应用于临床。多项专家共识指出银杏叶提取物对突发性聋、耳源性眩晕、神经血管性疾病等具有较好的临床疗效[7]，实验研究也表明银杏叶提取物可通过抑制细胞凋亡和抗氧化应激等药理机制，对噪声性聋等发挥预防和治疗作用[8-9]，但银杏叶提取物防治老年性聋的机制尚不明确。既往银杏叶提取物防治老年性聋的研究大多集中于临床观察，但未曾对机制进行深入探讨；也有应用网络药理学研究银杏叶提取物治疗突发性聋的研究，却缺少实验验证[10]。

为此，本研究在既往研究的基础上[8]，对研究方法进行改进与创新，以银杏叶提取物的有效成分为基础，借助网络药理学更直观的呈现其作用靶点及通路，并利用现代实验技术、将网络药理学得出的靶点、信号通路通过动物实验进行验证，来探索银杏叶提取物防治老年性聋的潜在机制，为临床上探索老年性聋的靶向治疗药物提供帮助。

2 研究思路内涵与实验方法流程图

2.1 研究思路的内涵

网络药理学是一门前沿、新兴、便捷、综合的学科，是一种基于虚拟预测、蛋白质相互作用和网络分析的新型工具，已被广泛应用于中医药领域。它通过将药物活性成分、疾病靶点基因与信号通路联系起来，为研究药物治疗疾病的具体分子机制提供了充足的证据[11]。为此，本研究人员提出基于网络药理学的银杏叶提取物防治老年性聋作用机制的研究，其内涵主要包括：①银杏叶提取物可能是通过多种有效成分作用于靶点基因、调控多条信号通路，进而改善老年性聋耳蜗组织的细胞形态和分子生物学功能，从而发挥延缓听力损失的作用；②本研究从银杏叶提取物治疗老年性聋众多的靶点基因与信号通路中筛选出相关性较高的靶点基因和信号通路，并结合多种实验方法进行验证。

2.2 实验方法流程图

见图1。

图1 实验方法流程图

3 研究与分析

3.1 银杏叶提取物的网络药理学材料与分析

3.1.1 活性成分靶点及疾病靶点筛选

通过TCMSP 中药系统药理学分析平台（https://tcmsp-e.com/）检索银杏叶的活性成分及靶点蛋白，根据口服利用度（OB）和类药性（DL），筛选出OB≥30%且DL≥0.18的活性成分，获得活性成分靶点蛋白，应用UniProt 数据库（https://www.uniprot.org/）对靶点标准化及去除重复值后获得靶蛋白对应的靶基因。利用GeneCards 数据库（https://www.genecards.org/）获得与老年性聋匹配的靶点基因，根据中位数≥5.68 筛选出疾病靶点基因，利用微生信的Venny 数据库（http://www.bioinformatics.com.cn/login/）获得药物成分及疾病靶点的交集靶基因。

3.1.2 GO和KEGG功能富集分析

通过String数据库（https://string-db.org/）构建疾病靶点蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）的数据及网路图。Metascape 数据库（https://metascape.org/gp/index）输入银杏叶活性成分及老年性聋的共同靶点基因，选择GO 的三种富集方式：生物过程（Biological Process，BP）、细胞成分（Cellular Component，CC）、分子功能（Molecular Function，MF）及KEGG 的数据，并将Logp转换为P值，去除重复值及降序后，筛选P＜0.05 的数据，利用微生信平台构建GO 的BP、CC、MF 三合一（enrichment GO term）网络图，应用富集气泡图（enrichment dot bubble）绘制KEGG通路图。

3.1.3 疾病-靶点-通路网络

用Cytoscape3.8.2 软件构建银杏叶提取物防治老年性聋的疾病-靶点-通路网络图。

3.2 动物实验

3.2.1 实验动物

选取4 周龄、体质量150-250 g、雌雄各半、听力阈值正常的SD 大鼠30只（河南华兴动物养殖中心，许可证号：SYXK(豫)2020-0002），于SPF 级温度、湿度和光照可控的环境中饲养，自由饮食和摄水，实验前适应性饲养7天。

3.2.2 试剂与仪器

银杏叶提取物（舒血宁注射液），北京华润高科天然药物有限公司，批号：Z11021351；Bax（批号：GTX32465）与Bcl-2（批 号：GTX100440）均 购 自genetex 公司；Myosin-Ⅶa，批号：256790，购自Protrus Biosciences 公司；Alexa Flour 488 Donkey ，批号：111-545-003，购 自Jackson ImmunoResearch 公 司；HRP Goat anti-Rabbit IgG，Proteintech 公 司，批 号：GTX213110-01；内参抗体GAPDH（批号：UBI6010）、SDS-PAGE 快速凝胶试剂盒（批号：UBI3002）、BCA 试剂盒（批号：UBI2006）均购自上海UBIYOBIBIO 公司；T-SOD（总超氧化物歧化酶，批号：MM-0731R1）、MDA（丙二醛，批号：MM-0385R1）和GST（谷胱甘肽S 转移酶，批号：MM-21254R1）均购自江苏宝莱（酶免）生物科技有限公司。

3.2.3 模型制备和给药方法

30 只SD 大鼠随机分为5 组，每组均6 只，分别为：对照组、模型组、银杏叶提取物低、中、高剂量组。除对照组外，其余各组大鼠均颈背部皮下注射剂量为500 mg·kg-1的D-半乳糖（用生理盐水配制），每日1次，连续给药8 周。对照组在颈背部皮下注射等量生理盐水，共8周。造模成功后，银杏叶提取物低、中、高剂量组分别注射10、20、30 mg·kg-1的舒血宁注射液，对照组及老年性聋组腹腔注射等体积的生理盐水，每日1次，连续8周。

3.2.4 免疫荧光染色耳蜗基底膜铺片

腹腔注射10%的水合氯醛麻醉，麻醉满意后断头取出耳蜗，灌注、固定、脱钙，将耳蜗用1XPBS 漂洗，解剖显微镜下用游丝镊、显微剪自蜗尖到蜗底小心的将耳蜗基底膜分离三段，顶回、中回、底回三段。用10%山羊血清与PBST 按照9:1 比例配置1%封闭液，将基底膜置于以上封闭液中封闭通透，4 摄氏度冰箱过夜。用封闭液按照1:500 的比例稀释一抗（Rabbit anti-Myosin-Ⅶa），4℃冰箱过夜。PBS 漂洗3 遍，每次10 min。用1% 封闭液与Alexa Flour 488 Donkey anti-Rabbit 二抗按照1:500 比例配置，避光孵育2 h，然后1:800比例将DAPI用1XPBS 稀释，室温孵育15 min，PBS漂洗3 遍，每次10 min，最后用抗猝灭甘油（Fluoromount-GTM）封片，荧光显微镜拍照。

3.2.5 酶联免疫吸附实验（ELISA）

将各组大鼠血清在4℃下解冻，离心后取上清，按照相应试剂盒中提供的说明配制GST、T-SOD 和MDA的标准品和样品，用酶标仪检测OD 值及标准曲线，最后分别计算含量。

3.2.6 透射电子显微镜

用移液枪将预冷的的2.5%戊二醛（pH 7.4）固定液自耳蜗蜗尖灌注，将灌注后耳蜗置于2.5%戊二醛固定液中4℃固定24 h，37℃恒温箱内脱钙1 周，用显微器械按照顶、中、底三段取下基底膜，PBS 漂洗3 次，用1%的锇酸4℃固定2 h，梯度乙醇，丙酮脱水，将组织包埋在环氧树脂中，进行超薄切片，切片用醋酸铀酰和柠檬酸铅双染色，染色后，使用日本透射电子显微镜（JEM-1400）拍照。

3.2.7 免疫印迹法（Western blotting）

首先，用剪刀剪开前庭，取出蜗轴和基底膜，称取20 μg，用消毒的剪刀剪碎组织样本，放入匀浆机内破碎耳蜗组织，加入250 μL 配制好的裂解液，冰上裂解10 min；4℃，12000 r·min-1离心30 min，取上清至新的离心管。然后根据BCA 试剂盒加入标准品及样品，在酶标仪绘制标准曲线及加上样缓冲液变性，计算最终蛋白上样量。制备SDS-PAGE 凝胶、电泳、将凝胶转移置PVDF 膜上、5%脱脂奶粉封闭1h、用Bcl-2（1:1,000）、Bax（1:1,000）和GAPDH（1:1,000）一抗在4℃冰箱中孵育过夜，利用HRP 标记的二抗在室温孵育2 h，最后使用ECL 超敏发光液和成像系统对形成蛋白条带的斑点进行定量，采用GAPDH 作为内参对照，对数据进行统一处理。

3.3 统计学方法

多个独立样本的数据采用均数±标准差表示，并使用SPSS25.0 软件进行统计学分析,多组间进行单因素方差分析（ANOVA），以P＜0.05为差异有显著性。

3.4 结果

3.4.1 银杏叶提取物的活性成分

经TCMSP 数据库初步检索，共获得307 个活性成分靶点，经过OB≥30%与DL≥0.18 筛选出银杏叶有效成分，UniProt 靶点基因标准化及去重后，得到215 个靶点基因，应用Cytoscape3.8.2软件构建银杏叶药物活性成分及潜在靶点网络图（图2）

图2 银杏叶提取物活性成分-潜在靶点网络图

3.4.2 老年性聋的疾病靶点及PPI网络构建

利用GeneCards 数据库获得与老年性聋匹配的靶点基因2713 个，根据中位数≥5.68 筛选出1358 个疾病靶点基因。Venny平台输入银杏叶活性成分靶点基因及老年性聋靶点基因，最终得到二者共同基因及绘制Venny 图（图3），其中共同基因110 个。String 数据库构建银杏叶活性成分与老年性聋共有靶蛋白之间的PPI 网络图（图4），该网络图包括110 个节点数，2020条边线，节点表示蛋白，边线表示蛋白间相互作用，边线越粗，表明蛋白间相互作用越强。

图3 银杏叶提取物活性成分靶点与老年性聋靶点的Venny图

图4 银杏叶活性成分与老年性聋共有靶蛋白之间的PPI网络图

3.4.3 靶点生物学功能富集分析

利用Metascape 数据库对银杏叶活性成分及老年性聋的110 个共同靶点基因进行功能富集分析，来获得GO 和KEGG 数据。其中包含10 条BP、CC、MF 的GO 富集（图5）。GO 富集结果发现生物过程主要与细胞衰老、细胞形态等相关；细胞成分与过氧化物酶体、谷氨酸突触等相关；分子功能与氧化还原酶的活性、细胞外配体门控离子通道活性等相关。KEGG包含10条，其中凋亡与谷胱甘肽代谢显著性较强（图6）。

图5 银杏叶提取物的GO（BP、CC、MF三合一）富集分析图

图6 银杏叶提取物KEGG 通路富集分析图

3.4.4 疾病-靶点-通路

将筛选的10 条KEGG 运用Cytoscape3.8.2 软件构建银杏叶提取物防治老年性聋的疾病-靶点-通路网络图，结果显示，与凋亡相关的靶点基因涉及到Bcl-2、Bax、AKT1、TNF 等；与谷胱甘肽代谢相关靶点基因涉及到：GSTP1、GSTM1等（图7）。

图7 疾病-靶点-通结果路网络图

3.4.5 免疫荧光染色耳蜗基底膜铺片

免疫荧光染色耳蜗基底膜铺片结果显示，对照组的三排外毛细胞和一排内毛细胞均排列整齐，细胞质饱满均一（图8A）。模型组三排外毛细胞明显缺失，内毛细胞干瘪、萎缩（图8B）。与模型组比较，银杏叶提取物低、中、高剂量组毛细胞形态逐渐改善，外毛细胞缺失明显降低（图8C、图8D、图8E），内毛细胞胞浆逐渐变大，尤以高剂量组作用最明显。

图8 各组大鼠耳蜗中观察毛细胞形态变化（×400，标尺：50 μm）

3.4.6 透射电子显微镜观察耳蜗螺旋神经节细胞超微结构变化

透射电子显微镜结果显示：对照组螺旋神经节细胞未见明显改变，线粒体嵴排列整齐，髓鞘神经纤维完整（图9A）；与对照组比较，模型组螺旋神经节细胞发生了严重破坏，线粒体空泡样改变，肿胀，溶解，螺旋神经节细胞胞浆内大量脂褐素及溶酶体聚集，并出现“脱髓鞘样”改变，线粒体嵴模糊不清（图9B）；与模型组比较，银杏叶提取物低剂量变化不明显，中、高剂量组螺旋神经节细胞损伤逐渐改善，线粒体嵴逐渐恢复正常，脱髓鞘现象好转，脂褐素及溶酶体数量降低（图9C、图9D、图9E）。

图9 螺旋神经节细胞线粒体超微结构（标尺1 μm）

3.4.7 各组大鼠血清中GST、T-SOD和MDA含量变化

与对照组比较，模型组GST 和T-SOD 含量显著降低（P＜0.01），而MDA 含量明显升高（P＜0.01）。与模型组相比，经不同剂量银杏叶提取物治疗后，GST 和TSOD 含 量 逐 渐 提 高，MDA 含 量 显 著 下 调（P＜0.05）（表1）。

表1 血清GST、T-SOD、MDA含量变化（n=6）

3.4.8 各组大鼠耳蜗组织Bcl-2、Bax 蛋白表达及Bcl-2/Bax比值变化

模型组Bcl-2 蛋白表达和Bcl-2/Bax 比值均明显低于对照组（P＜0.01），Bax 蛋白表达高于对照组（P＜0.01）。与模型组对比，银杏叶提取物低、中、高剂量各组Bcl-2 蛋白表达和Bcl-2/Bax 比值均显著升高，而Bax 蛋白表达明显降低（P＜0.05）（图10A、图10B、图10C）。

图10 银杏叶提取物对衰老大鼠Bax、Bcl-2蛋白表达及Bcl-2/Bax比值的影响

4 讨论

老年性聋是最常见的慢性退行性疾病之一，是耳蜗老化、环境等多种因素、多个靶点共同作用的结果。老年性聋的发病机制仍不十分明确，细胞凋亡和氧化应激在其发生发展中起着关键的作用[12]。正常情况下，耳蜗螺旋神经节细胞线粒体产生的ROS、MDA 易被内源性抗氧化系统相关因子如SOD 和GST 等清除，从而维持内耳稳态。随着年龄的增长，螺旋神经节细胞线粒体的抗氧化防御功能下调，SOD 和GST 活性显著降低，而ROS聚集、MDA活性明显升高，引起螺旋神经节细胞氧化损伤，螺旋神经节细胞纤维和韧带与毛细胞连接，其进一步导致毛细胞丢失与变性[13]。另外，Bcl-2/Bax 信号通路是联系螺旋神经节细胞线粒体内外凋亡途径的重要桥梁，Bcl-2 蛋白家族主要包括抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax，二者比值是决定螺旋神经节细胞活性以及毛细胞形态的关键因素。当Bcl-2 表达相对高于Bax 时，Bcl-2 可与促凋亡蛋白Bak1、Bax 等结合来抑制细胞凋亡；当Bax 表达相对高于Bcl-2 时，Bax/Bax 结合促进细胞凋亡[14]。在衰老的内耳组织中，螺旋神经节细胞超微结构破坏，线粒体氧化损伤诱导氧化呼吸链活性降低并使线粒体膜通透性升高，引起Bax 大量释放，其抑制Bcl-2 的转录及功能，最终导致螺旋神经节细胞凋亡，进而加重毛细胞退变[15]。Falah 等[16]研究表明，老年性聋C57BL/6J 小鼠的Bak1/Bcl-2 比值显著升高，且比值与听力阈值呈正相关，而Bak1 基因缺失的C57BL/6J 小鼠即使在氧化应激条件下，也可减少细胞凋亡，减轻螺旋神经节细胞的损伤和毛细胞的丢失，从而延缓老年性聋的发病进程。因此，阻止或延缓内耳细胞氧化应激损伤和细胞凋亡可能是治疗老年性聋的重要靶点。

迄今为止，临床上对老年性聋的治疗手段十分匮乏，研究发现鼓室内注射糖皮质激素对早期老年性聋患者具有一定疗效，但该治疗易导致鼓膜穿孔[17]；阿司匹林虽可延缓老年性聋听力损伤，但由于其本身也具有一定的耳毒性，合适的药物剂量很难把握，导致了临床应用的局限性[18]；陈望燕等[19]研究发现，葛根素能改善老年性聋大鼠听功能，然而其可致血液、消化、泌尿等多系统出现不良反应；耳聋左慈丸在治疗老年性聋方面已被人们所熟知，但疗效仍存在众多争议[20]。

既往研究已证实银杏叶提取物可通过抗氧化、抗凋亡等作用治疗内耳疾病，因此，通过对GO、KEGG 富集、疾病-靶点-通路图分析，发现银杏叶提取物治疗老年性聋的潜在通路包括细胞凋亡通路和氧化应激相关的谷胱甘肽代谢通路，潜在靶点基因分别涉及Bcl-2、Bax、AKT1、TNF等和GSTP1、GSTM1等。

本研究选择检测GST、MDA 和T-SOD 等氧化应激相关因子，Bcl-2和Bax等凋亡相关蛋白进行验证。模型组大鼠血清MDA 含量、Bax 蛋白均升高，GST、TSOD含量、Bcl-2蛋白和Bcl-2/Bax比值均降低，经不同剂量银杏叶提取物治疗后，发现GST、T-SOD 含量、Bcl-2 蛋白和Bcl-2/Bax 比值均显著提高，而MDA 含量、Bax 蛋白均降低。同时通过免疫荧光染色和透射电子显微镜观察毛细胞及螺旋神经节细胞变化情况，结果显示，模型组毛细胞大量丢失，螺旋神经节细胞超微结构明显破坏，而银杏叶提取物治疗后毛细胞及螺旋神经节细胞损伤逐渐改善。以上结果进一步证实银杏叶提取物对老年性聋具有保护作用，其机制可能是银杏叶提取物通过Bcl-2/Bax 信号通路来调控衰老耳蜗组织中Bcl-2、Bax 的表达，升高Bcl-2/Bax 比值，维持GST、MDA、T-SOD 等氧化/抗氧化平衡，减轻线粒体去极化，保护线粒体膜的稳定性，从而抑制毛细胞、螺旋神经节细胞及线粒体损伤，进而延缓听力损失[21]。本研究与既往研究结果一致，Li 等[22]也认为银杏叶提取物可通过Bcl-2/Bax 信号通路减轻氧化应激，抑制线粒体介导的Bax的激活，促进Bcl-2的表达，进而阻断神经元细胞凋亡。本研究局限性在于，只进行体内动物实验，未进行体外细胞实验，也未在基因水平对Bcl-2、Bax、AKT1、TNF、GSTP1、GSTM1 等靶点基因的mRNA 进行验证，这些将是我们今后研究的重点。

5 结论

综上所述，我们使用网络药理学和动物实验相结合的方法，突出了银杏叶提取物对老年性聋的“多成分，多靶点，多通路”治疗效果，该研究证实银杏叶提取物可能通过Bcl-2/Bax 通路减轻耳蜗螺旋神经节细胞和毛细胞的凋亡和氧化应激来延缓听力损失，但老年性聋的发病机制相对复杂，我们还需要更多基础实验从多层次来探讨银杏叶提取物保护内耳的潜在机制，从而为针对老年性聋多靶点药物的设计与研发提供依据。