一种利用蜗牛酶转化重楼皂苷VI制备偏诺皂苷元的方法＊

2022-09-29王亢宗田济铭张嘉颀薛哲勇

世界科学技术-中医药现代化 2022年5期

王亢宗，李敏，田济铭，张嘉颀，薛哲勇，宋伟，华欣

（东北林业大学生命科学学院哈尔滨 150006）

重楼皂苷（polyphyllin）是重楼植物（Paris polyphylla）中一类重要次生代谢产物，已被报道具有多种良好的药理活性，包括抗肿瘤，抗氧化，抗炎，抗菌，促凝血，修复胃黏膜等[1-9]。重楼皂苷结构多样，以薯蓣皂苷型和偏诺皂苷型为主。植物中通过甲羟戊酸途径合成2,3-氧化鲨烯，由环阿屯醇合酶环氧化形成环阿屯醇，再经过去甲基、还原、异构、羟化等多步反应合成薯蓣皂苷元（diosgenin），薯蓣皂苷元C-17位的氢被羟基取代，形成偏诺皂苷元（pennogenin）[10-11]。而后，在苷元C-3 和C-26 位连接D-葡萄糖、L-鼠李糖和L-阿拉伯糖，进而产生多种重楼皂苷。近年来，含C17α-OH 的甾体天然产物因其有趣的结构和多样的生物活性而受到广泛关注，C17α-OH 的存在对它们的生物活性至关重要，因此如何大量获得含C17α-OH 的甾体的骨架对该类化合物的研究具有重要的意义。

偏诺皂苷元通常与糖基结合形成糖苷，在植物中稳定存在，其自身几乎不能通过常规酸水解分离提取[12]。同时，对包括七叶一枝花在内的多种重楼属植物资源的过度开发造成了其资源匮乏[13]。目前已有利用化学方法合成偏诺皂苷元的报道，例如在薯蓣皂苷元引入C17α-OH，但存在反应步骤繁琐、条件苛刻、产率低、毒副作用等问题。近年，已有一些使用商业酶转化苷类获得苷元的研究，具有反应条件温和、转化率高、无污染和成本低廉等优点[14-17]。因此，通过商业酶转化偏诺类皂苷，可能成为大量制备偏诺皂苷元的可行方法。蜗牛酶是从蜗牛的嗉囊和消化道中提取的一种混合酶[9]，目前已明确其含有纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、蛋白酶等20多种酶，具有很强的生物转化能力，能够特异性切割β-D-吡喃葡萄糖苷键。重楼皂苷VI是在偏诺皂苷元C-3位连接二糖，相对较易提取分离，适合作为转化的原料。本文研究了蜗牛酶转化重楼皂苷VI获得偏诺皂苷元的制备条件，确定了影响转化率的多个因素，通过响应面分析法确定了最佳酶解条件，开发了一种利用蜗牛酶在较短时间内转化重楼皂苷VI制备偏诺皂苷元的水解方法，且具有较高的产率。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

Ultimate 3000 型高效液相色谱仪，包括紫外检测器（美国Thermo 公司）；恒温混匀仪MTH-100（杭州米欧仪器有限公司）；真空离心浓缩仪CV200（北京吉艾姆科技有限公司）；万分之一电子天平SQP（德国Sartorius公司）；超声波清洗机SB-5200DTD（宁波新芝生物科技股份有限公司）；PB-10 型pH 计（德国Sartorius公司）。

重楼皂苷VI标准品（成都普瑞法科技开发有限公司）；蜗牛酶（BBI生命科学有限公司）；色谱甲醇、乙腈（德国Merck公司）；其余试剂为分析纯。

1.2 蜗牛酶转化重楼皂苷VI反应体系构建

称取重楼皂苷VI 20.0 mg，与适量蜗牛酶加入20.0 mL 乙酸钠缓冲液中，适宜温度下反应一定时间后，加入等量体积的甲醇终止反应，在真空离心浓缩仪中干燥。反应沉淀用色谱甲醇溶解浓缩，0.45 μm滤膜过滤，滤液通过高效液相色谱分离获得偏诺皂苷元。色谱条件：Hypersil GOLD C18 液相色谱柱（250×10 mm，5 μm）；流动相为高纯水（A）和乙腈（B），梯度洗脱（0-2 min，30-40% B；2-6 min，40-80% B；6-7 min，80-100% B；7-13 min，100% B；13-15 min，100-30% B）；流速5.0 mL·min-1，柱温30°C，检测波长203 nm，进样量100 μL。

1.3 偏诺皂苷元转化率测定

色谱条件：HypersilGOLD C18 液相色谱柱（250×4.6 mm，5 μm）；流动相为高纯水（A）和乙腈（B），梯度洗脱（0-3 min，50% B；3-5 min，50-80% B；5-10 min，80-100% B；10-13 min，100% B；13-14 min，100-50%B；14-15 min，50% B）；流速1.0 mL·min-1，柱温30°C，检测波长203 nm，进样量10 μL。转化率=SHPLC(偏诺皂苷元)/SHPLC(偏诺皂苷元)+SHPLC(重楼皂苷VI)。

1.4 重楼皂苷VI和偏诺皂苷元标准曲线绘制

精密量取重楼皂苷VI 标准品以及分离获得的偏诺皂苷元，加色谱甲醇分别稀释成100 μg·mL-1、50 μg·mL-1、25 μg·mL-1、15 μg·mL-1、5 μg·mL-1溶液。以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，通过线性化获得重楼皂苷VI与偏诺皂苷元的回归方程，。

1.5 单因素实验设计

设置酶用量、反应温度、反应时间和pH 值四个因素实验，每个反应中重楼皂苷VI 用量为100 μg，反应体积300 μL。其中，反应时间梯度实验固定酶用量为0.5 mg，反应温度37°C，pH = 5.0，反应时间设定为12 h、24 h、36 h、48 h、72 h；酶用量梯度实验固定反应时间为24 h，反应温度37°C，pH 5.0，酶用量分别为0.1 mg、0.2 mg、0.5 mg、1.0 mg、2.0 mg；反应温度梯度实验固定反应时间为24 h，酶用量为0.5 mg，pH=5.0，反应温度分别为20°C、28°C、37°C、50°C、60°C；反应pH 梯度实验设置反应时间为24 h，酶用量为0.5 mg，反应温度37°C，反应pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0。

1.6 正交实验设计

根据单因素实验结果，设计三水平四因素的正交实验（表1）。

1.7 数据处理

以单因素实验数据作为输入数据，利用python statsmodels v0.13.1库进行多项式回归，递增degree 值，计算相应的R-squared 值，选择首个R-squared 极大值对应的模型作为拟合结果；以单因素实验数据和正交实验数据作为输入数据，利用Design Expert 12 软件进行响应面分析，通过多次拟合下每个因素对应的pvalue值确定模型的最终结果，并求解最优反应条件及转化率。

2 结果

2.1 偏诺皂苷元的制备与鉴定

经过液相色谱检测，重楼皂苷VI标准品出峰时间为7 min。蜗牛酶将重楼皂苷VI酶解后，在10.5 min出现了新的产物峰（图1）。收集足量的产物后，通过核磁分析，与报道的数据比对，确认酶解后的产物为偏诺皂苷元。核磁结果如下，偏诺皂苷元：白色粉末;1H-NMR (500 MHz, CD3OD)δH0.81 (3H, d,J= 6.0 Hz,H-27), 0.85 (3H, s, H-18), 0.90 (3H, d,J= 7.5 Hz, H-21), 1.05 (3H, s, H-19), 3.50 (1H, m, H-3), 4.02 (1H,dd,J= 7.5 Hz, 6.5 Hz, H-16), 5.36 (1H, m, H-6);13CNMR (125MHz, CD3OD)δC38.5 (C-1), 33.2 (C-2), 72.4(C-3), 43.0 (C-4), 142.3 (C-5), 122.2 (C-6), 32.3 (C-7),32.9 (C-8), 51.4 (C-9), 37.8 (C-10), 21.7 (C-11), 32.5(C-12), 45.5 (C-13), 53.9 (C-14), 31.3 (C-15), 90.6 (C-16), 91.3 (C-17), 17.49 (C-18), 19.9 (C-19), 45.8 (C-20), 9.1 (C-21), 110.9 (C-22), 32.1 (C-23), 29.4 (C-24),33.3(C-25),67.7(C-26),17.52(C-27)。

图1 高效液相分离重楼皂苷VI与蜗牛酶的酶解产物

2.2 偏诺皂苷元转化率单因素实验

2.2.1 反应时间对偏诺皂苷元转化率的影响

控制酶解反应温度为37°C、酶用量为0.5 mg（每100 μg 底物），反应pH 5.0，转化率随反应时间的变化如图2A 所示。回归模型的degree 值设为2，模型Rsquared 值约为0.99，表明回归模型较好的拟合实验数据。模型显示在此条件下，酶解反应时间在12 h到40 h 的区间中，转化率随时间变化近似一次函数，此时若继续增加酶用量或提高酶效率反应会进一步加快；60 h 后反应几乎达到稳定状态，此时酶量已经不是制约转化率的因素。根据此结果，后续正交实验反应时间设置为24 h、48 h和72 h三个水平。

2.2.2 酶用量对偏诺皂苷元转化率的影响

控制酶解反应温度为37°C、反应时间为24 h，反应pH 5.0，转化率随酶用量的变化如图2B所示。回归模型的degree 值设为3，模型R-squared 值约为0.99，表明回归模型较好的拟合实验数据。模型显示在此条件下，酶用量在0.1 mg至0.5 mg的区间中，转化率随时间变化近似一次函数，此时若继续增加反应时间或提高酶效率，转化率会进一步上升；酶用量在1.5 mg左右反应几乎达到平衡，此时即使增加反应时间转化率也不会有大的增加。根据此结果，后续正交实验反应酶用量设置为0.5 mg（每100 μg 底物）、1.0 mg（每100 μg底物）和1.5 mg（每100 μg底物）三个水平。

2.2.3 反应温度对偏诺皂苷元转化率的影响

控制酶解反应时间为24 h，酶用量为0.5 mg（每100 μg 底物），反应pH 5.0，转化率随反应温度的变化如图2C 所示。回归模型的degree 值设为4，模型Rsquared 约为0.99，表明回归模型较好的拟合实验数据。模型显示在此条件下转化率在20°C 到35°C 的区间中上升，在35°C 至40°C 间有最大的转化率，40°C 后开始下降，并在60°C 附近趋于平稳。根据此结果，可以确定此条件下转化率峰值出现在30°C 至50°C 之间，据此，后续正交实验设置反应温度为28°C、37°C和50°C三个水平。

2.2.4 反应pH值对偏诺皂苷元转化率影响

控制酶解反应温度为37°C，反应时间为24 h，酶用量为0.5 mg（每100μg 底物），转化率随反应pH 值的变化如图2D 所示。回归模型的degree 值设为3，模型R-squared约为0.99，表明回归模型较好的拟合实验数据。模型显示在此条件下，反应pH 值在4.0 至5.0 的区间中，转化率随反应pH 快速上升，反应pH 值在6.0至8.0 的区间中转化率随pH 值下降。值得一提的是，相较前三个梯度实验，即使在条件设置完全相同的实验下，此梯度实验中的转化率也有近3倍提升（补充表1-表4），我们通过测定的重楼皂苷VI 和偏诺皂苷元标准曲线计算了各梯度实验上样溶液理论初始重楼皂苷VI 含量，在另外3 组实验中，这个值稳定在4.5-5.5 μg·μL-1，而在pH 梯度实验中则在6.0-15.0 μg·μL-1波动（补充表1-表4），这可能源于加样量误差导致的实验体系波动，故在之后的模型建立中删除此部分数据。此结果虽然不能真实的反映pH 值和转化率的关系，但结合以往的报道，此条件下转化率的峰值应出现在pH 值为5.0 至6.0 的区间中，依此，设置后续正交实验反应pH值为4.5、5、6三个水平。

图2 单因素考察蜗牛酶转化重楼皂苷VI的转化率

2.3 偏诺皂苷元转化率正交实验与响应面分析

根据单因素实验的结果，进行四因素三水平的正交实验，实验设置与产率见表1。将正交实验与单因素实验结果合并（剔除可能因实验操作带入误差的pH梯度实验），使用Design Expert 12 进行响应面分析，根据每次回归模型每个因素及其交叉项的置信度（pvalue＜=0.05）迭代模型以确定最终模型。模型拟合概要如表2所示，拟合结果表明，二次方程拟合具有最高的置信度和最大的R-squerd，可以很好的解释实验数据。简化二次模型方差分析如表3 所示，模型和参与模型的每一项因素的p-value 均小于0.05，且lack of fit大于0.1，表明由这些因素构建的模型可以较好的拟合实验数据，设pH 值为A，酶用量为B，温度为C，时间为D，转化率为Y×100%，则模型为Y = -4.42669 +1.35859A + 0.676821B + 0.029450C + 0.013159D -0.003588BD-0.127014A2-0.181855B2-0.000406C2-0.000071D2。该模型表明，酶用量和反应时间对转化率的影响不是独立的（图3），其他条件一定，更少的酶用量则需要更多的时间来达到反应平衡态；反应温度和pH 对转化率的影响是独立的。依此模型，计算使反应转化率达到最大的最优因素水平约为：反应酶用量1.26 mg（每100μg底物），反应时间60.7 h，反应温度36.3°C，pH 5.35；预测转化率约为57%。

图3 酶用量与反应时间相互作用对偏诺皂苷元产率的影响

表2 模型拟合概要

表3 简化二次模型方差分析

2.4 模型性能验证

在实际应用中，往往希望在转化率和反应时间两者中寻找一个平衡点，即在较短的时间内获得较高的转化率，我们设置了3组反应，即限制反应时间分别在24 h、36 h、48 h 内，计算这3 个条件下的最高转化率。当反应时间设置在24 h 内，模型最优条件为：反应pH=5.348、酶用量为1.624 mg（每100 μg 底物）、温度为36.261°C、反应时间为24 h，理论产率为49.5%；为方便实验操作，我们使用反应pH 为5.35，酶用量为1.6 mg（每100μg底物），反应温度为37°C进行验证，求得平均产率为47.0%，与理论产率误差为5%。当反应时间设为36 h 内，模型最优条件为：反应pH = 5.348，酶用量1.512 mg（每100 μg底物），反应温度为36.260°C，反应时间为36 h，理论产率为53.4%；为方便实验操作，我们使用反应pH = 5.35，酶用量为1.5 mg（每100 μg 底物），反应温度为37°C 进行验证，求得平均产率为51.5%，与理论产率误差为3.5%。当反应时间设为48 h 以内，模型最优条件为：反应pH = 5.348，酶用量为1.388 mg（每100 μg底物），反应温度为36.265°C、反应时间为48 h，理论产率为55.8%；为方便实验操作，我们使用反应pH = 5.35，酶用量为1.4 mg（每100 μg底物），反应温度为37°C 进行验证，求得平均产率为53.8%，与理论产率误差为3.6%。三次验证的实际产率和理论产率的误差都在5%以内，证明了我们模型的准确性。

3 讨论

本研究通过高效液相分离和核磁分析，制备并鉴定了偏诺皂苷元。相比天然提取与化学法合成偏诺皂苷元，蜗牛酶水解重楼皂苷VI制备偏诺皂苷元具有廉价，反应条件温和，转化率高，位点特异性强，污染率低等优势，适合实验室制备，且可能应用于工业化生产。但受限于实验条件，我们无法进行中试以确定其工业化生产应用的潜力。本研究比较了反应时间、酶用量，反应温度和反应pH 值对蜗牛酶水解重楼皂苷VI 转化率的影响，结果表明这4 个因素在一定取值范围内都与反应效率有较强关联。其中，随着反应时间和酶用量的升高，转化率首先升高，继而维持在一个稳定的水平；而随着反应温度和pH 的升高，转化率则经历一个先升后降的过程，表明过高或过低的温度和pH 会降低蜗牛酶的活性，同时也会影响酶反应本身的平衡态。在4 个因素中，反应时间和酶用量对转化率的影响是交互的，这是因为时间和酶用量本身并不影响最终反应平衡态，如果将反应达到平衡理解为反应完成，则它们对产率的影响实则是对该条件下时间节点此反应完成到什么程度的影响，而时间和酶用量的变化本质上是在这个样本空间下有多少底物与酶接触这一潜在因子。而温度和pH 则更直接地改变酶本身的性质和反应的平衡态。对于温度，较高时酶分子内较弱的相互作用，如范德华力、氢键等被破坏，酶的高级结构发生改变，进而影响酶催化活性，而水解反应本身是吸热反应，温度较低时反应更难发生，同时酶活也下降。对于pH，过碱的pH 不利于糖苷酶从溶剂中获取质子，过酸的条件不利于糖苷酶释放质子攻击糖苷[18]，他们从不同层面影响反应速率的同时还影响反应的平衡状态，但究竟是一者不会响应另一者改变，还是二者对酶与反应平衡的影响复杂且微妙而难以捕获尚不明确。此外，目前有研究显示一些金属离子可以促进部分β-葡萄糖苷酶的活性[21]，但在蜗牛酶相关的β-葡萄糖苷酶报道中，金属离子普遍被认为抑制酶的水解活性[15,22]。我们尚未从蜗牛酶中分离出催化重楼皂苷VI水解的纯酶，但若能基于明确的酶分子结构，研究酶与金属离子间分子上的互作与酶活力的关系将有助于提升反应产率，揭示激活抑制作用机制，从而为后续放大实验以及工业化提供理论指导。

蜗牛酶是一种含有β-葡萄糖苷酶、纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、蛋白酶等多种酶的粗糖苷酶。刘欣等从蜗牛酶中分离纯化出对人参皂苷Rbl具有较高水解活性的β-葡萄糖苷酶[19]，因此我们推测蜗牛酶中主要起到水解作用的成分是葡萄糖苷酶。目前，有研究表明蜗牛酶能水解芦丁（rutin）末端的葡萄糖苷键，直接生成槲皮素（quercetin），而没有鼠李糖苷断裂的中间产物异槲皮苷（isoquercetin）形成[20]。同时，未见蜗牛酶成分中有鼠李糖苷酶的相关报道，在液相色谱检测时也未发现中间产物偏诺皂苷元-3-O-葡萄糖苷的积累。因此我们认为蜗牛酶不具备水解鼠李糖苷键的能力。我们推测，重楼皂苷VI 经过蜗牛酶中的β-葡萄糖苷酶作用，断裂C-3 位末端的葡萄糖苷键，脱掉二糖生成偏诺皂苷元（图4）。因此。为方便转化率的计算，我们使用：

图4 蜗牛酶水解重楼皂苷VI生成偏诺皂苷元

在一定范围内，重楼皂苷VI和偏诺皂苷元色谱标准曲线是一次的，令S表示峰面积、m表示质量、k表示标准曲线一次项系数、c表示常数项系数，1和2分别表示（终止反应时色谱体系中）重楼皂苷VI 和偏诺皂苷元，则有S1 = k1m1 + c1、S2 = k2m2 + c2。令t 表示体系中初始重楼皂苷质量，m3 表示发生转化的重楼皂苷VI，Mr表示相对分子质量，则有：

转化率=，即转化率是随体系中转化的重楼皂苷VI 增加的单调函数。令转化率为α即α=，则有，对其求导并化简，得K2tC - K2tc2+k1tc2，其中K2= k2，C=c1+ c2+ k1t，带入得k2tc1+k1k2t2+ k1tc2；其中，k1，k2表示标准曲线一次项系数，所以k1＞0，k2＞0；t 为体系中初始重楼皂苷VI 质量，即t＞0；c1，c2分别表示标准曲线常数项系数，其实际含义应为测量仪器对重楼皂苷VI和偏诺皂苷元的底噪，理想条件下应当大于等于0，在我们实际实验测量下，分别为0.0041 和0.0733（见补充表5-表8）；则的导数在我们实验的条件下恒大于0，即其在转化率α在区间（0，1）中是单调递增的，因此是转化率α 在区间（0，1）上的单调递增函数，通过来替代转化率α 以简化计算是科学的，我们的实验结果也验证了这一点。

最后，本研究建立的模型预测转化率和实际转化率误差在5%以内，说明模型对提高蜗牛酶转化重楼皂苷VI 的效率有指导意义。单因素实验与正交实验中重楼皂苷VI 的转化率最高为48.6%，在模型预测的优化条件下，反应36 h转化率可以达到51.5%，在节省四分之一时间的同时产率提高了3%。反应优化后的偏诺皂苷元得率高，耗时短，成本低，可能对工业生产有指导作用。