电针“梨状二穴”对腰椎间盘突出症大鼠NPY、SP及神经节的影响

2022-05-18朱笑举潘锋陈妍蓓陈致宏郑永仁尹梅芳刘正

云南中医中药杂志 2022年5期

朱笑举潘锋陈妍蓓陈致宏郑永仁尹梅芳刘正

摘要：目的觀察电针“梨状二穴”对腰椎间盘突出症模型大鼠的神经肽NPY、SP及背根神经节的影响。方法将32只SD大鼠随机分为空白组、模型组、电针1组和电针2组，每组8只。治疗6 d后，腹主动脉采血取各组大鼠血清，采用ELISA法检测各组血清中神经肽（NPY、SP）含量，并在各组中随机取2只大鼠的背根神经节进行HE染色观察其病理改变。结果模型组血清NPY、SP含量较空白组、电针1组、电针2组均升高，且差异具有统计学意义（P<0.05）;电针1组、电针2组血清NPY、SP含量均低于空白组，差异具有统计学意义（P<0.05）;电针1组血清NPY、SP含量低于电针2组，差异具有统计学意义（P<0.05）。模型组大鼠背根神经节细胞出现病理性改变;电针1组及电针2组背根神经节细胞得到一定程度的恢复。结论电针“梨状二穴”降低了致痛因子如NPY、SP在外周的含量，促进了背根神经节的细胞组织形态的修复，从而减轻炎症反应，降低疼痛程度，消除疼痛症状。

关键词：梨状二穴;腰椎间盘突出症;NPY;SP;神经节

中图分类号：R245.9 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2022）05-0066-05

Effects of Electro-acupuncture at Piriform Two Points on NPY， SP and Ganglia in Ratswith Lumbar Disc Herniation

ZHU Xiao-ju1， PAN Feng1， CHEN Yan-bei1， CHEN Zhi-hong1， ZHENG Yong-ren2， YIN Mei-fang1， LIU Zheng1

（1. Qujing Hospital of Traditional Chinese Medicine， Qujing 655000， China;2. Yunnan University of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650500， China）

【Abstract】Objective： To observe the effect of electro-acupuncture at “two piriform points” on the neuropeptides NPY， SP and dorsal root ganglia in lumbar disc herniation model rats. Methods： 32 SD rats were randomly divided into blank group， model group， electro-acupuncture group 1 and electro-acupuncture group 2， 8 rats each group. After 6-day treatment， their blood was collected from the abdominal aorta to obtain the serum of the rats in each group， and the serum neuropeptide （NPY and SP） content of each group was detected by ELISA. The dorsal root ganglia of 2 rats from each group were randomly selected to observe the pathological changes by HE staining. Results： Compared with that of the blank group， EA group 1 and EA group 2， the serum NPY and SP levels of the model group were increased and the differences were statistically significant （P<0.05）. The serum NPY and SP contents of the EA group 1 and EA group 2 were lower than those of the blank group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The serum NPY and SP contents of the EA group 1 were lower than those of the EA group 2， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The dorsal root ganglion cells of the rats in the model group showed pathological changes and the dorsal root ganglion cells of the EA group 1 and 2 groups recovered to a certain extent. Conclusion： Electro-acupuncture at “Piriform Two Point” reduces the content of pain-inducing factors such as NPY and SP in the periphery and promotes the repair of cell tissue morphology in the dorsal root ganglion， thereby alleviating the inflammatory response， reducing the degree of pain and eliminating pain symptoms.

【Key words】Piriform Two Points; Lumbar Disc Herniation; NPY; SP; Ganglion

腰椎间盘突出症（lumbar disc herniation，LDH）是一种临床常见的多发病，主要是由于腰椎间盘退行性改变，导致腰椎间盘纤维环发生部分或完全断裂，内部髓核向外突出刺激或压迫脊神经根导致神经根发生炎症反应[1]，表现为腰痛、下肢麻木或疼痛，严重者甚至出现下肢活动障碍，严重影响患者的日常生活和工作。当前随着人们生活方式的转变，该病的发病率正在逐年上升，且复发率较高。笔者自创“梨状二穴”，经过十余年的临床应用，在治疗腰椎间盘突出症等疾病方面取得了很好疗效[2-3]，但其作用机理尚待进一步研究。本实验意在通过电针“梨状二穴”对腰椎间盘突出症模型大鼠的神经肽（NPY、SP）及背根神经节形态的影响探索“梨状二穴”的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物健康成年SD大鼠（湖南斯莱克景达实验动物有限公司）体重（200±20）g，动物级别为清洁级，动物房符合SPF屏障系统，温度25℃，相对湿度45%，气压保持在适宜范围内。实验过程中，所有动物在同等条件下饲养，自由饮水和摄食。动物适应性饲养三天后进行正式实验，避免实验误差。实验设计符合本院动物实验伦理学规定。

1.2 实验仪器与试剂 0.25 mm×13 mm规格一次性使用无菌针灸针;华佗牌SDZ-11电针仪;热刺痛仪;25 、50 μL微量注射器;9号腰椎穿刺针;电子天平;移液枪;抗凝离心管;低温离心机;病理切片机;酶联免疫检测仪器;超低温冰箱;盐酸利多卡因注射液;P物质（SP）试剂盒;神经肽Y（NPY）试剂盒;1%氯胺酮50 mg/kg;高效切片石蜡;苏木素-伊红染液;消毒纱布、干棉球若干。

1.3 分组方法大鼠32只，按体重编号1～32号，随机分为4组，每组8只，分别为（1）空白组：不做造模及治疗处理，但是做断尾处置，以防偏倚。（2）模型组：造成非压迫腰椎间盘突出神经根压迫症状模型，但不做治疗处理。（3）电针1组：造成非压迫腰椎间盘髓核突出大鼠模型后选择“梨状二穴”进行電针治疗。（4）电针2组：造成非压迫腰椎间盘髓核突出大鼠模型后选择环跳-秩边配伍进行电针治疗。

1.4 造模方法参照陆志东等[4]非压迫性腰椎间盘髓核突出模型的造模方法。术前1 d，1%氯胺酮50 mg/kg腹腔注射麻醉后将大鼠背部的毛剪短并用脱毛剂脱毛。手术时采用1%氯胺酮50 mg/kg腹腔注射麻醉，将大鼠尾部和背部消毒，铺无菌巾，距尾根部1 cm处切断鼠尾并缝合伤口，切开尾部椎间盘，见髓核呈胶冻样，取5个髓核并加入50 μL生理盐水，充分搅拌成混悬液备用。髓核混悬液制备完成后，将除空白组以外的大鼠置于屈曲侧卧位，以L4～5棘突间隙为穿刺点用9号腰椎穿刺针行硬膜外穿刺，成功后用微量注射器注射50 μL大鼠自体髓核混悬液，接着将2%利多卡因25 μL注射到硬膜外腔中，拔除穿刺针，大鼠放入笼中观察。氯胺酮麻醉恢复后，大鼠四肢活动自如，说明硬膜外穿刺和注射失败;双前肢活动自如，双后肢运动、感觉丧失或减退，20～30 min后完全恢复，说明硬膜外穿刺注射成功，可继续进一步的观察。

1.5 针刺干预

1.5.1 “梨状二穴”定位 “梨状二穴”包括“梨状肌1”和“梨状肌2”两个穴位，其定位如下：“梨状肌1”位于大鼠梨状肌近骶骨端，大鼠秩边穴直上5 mm;“梨状肌2”位于梨状肌近股骨大转子端，大鼠环跳穴直上2.5 mm。

1.5.2 干预方法造模成功后，所有大鼠均给予正常饲养。空白组、模型组不予干预，但在每天的治疗时间要将其提拿出笼，以保证和其余大鼠刺激条件相同。电针1组、电针2组均在造模成功后第4 d开始干预，每日1次，共6次。电针1组：针“梨状二穴”，直刺5～7 mm，接华佗牌SDZ-11电针仪，以连续波刺激，频率2 Hz，强度2 mA（以大鼠后下肢出现轻微抽动但不挣扎为佳），留针时间30 min。电针2组：针环跳、秩边，直刺5～7 mm，治疗方法与电针1组相同。

1.6 观察指标的检测

1.6.1 后肢热刺激缩爪阈值的检测空白组、模型组、电针1组、电针2组大鼠，分别在造模前、造模结束后的第1、3 d及治疗后的第2、4、6 d对右侧后肢热刺激缩爪阈差值进行检测。于室温25℃左右将大鼠静置于痛觉测试仪玻璃板上并用配套透明塑料固定笼分隔，适应10 min安静后用辐射热光源（55±5）℃对准足底中部外侧，记录大鼠出现疼痛反应即缩腿甚至舔足的时间（即痛阈潜伏期），测量2次取平均值，每次间隔1 h。若照射50 s仍无反应，则取出大鼠防止足底组织烫伤，按50s计算，使用自身前后对照方法进行对比。

1.6.2 血清取样及检测治疗6 d后腹主动脉采血，取血5 mL放入抗凝的试管中，用4℃离心4000 rpm离心15 min，分离血清，置于-20℃保存应用酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）测定标本中NPY、SP含量。测定严格按试剂盒说明进行操作。

1.6.3 背根神经节取样及检测治疗6 d后，每组随机抽取2只大鼠，对其进行腹腔麻醉，麻醉剂为1%氯胺酮50mg/kg进行注射，麻醉后从大鼠臀部肌肉进行解剖，暴露坐骨神经，沿着坐骨神经往上解剖脊柱关节至L5～S1椎间孔处，剪开椎板，将椎间孔里面的神经充分暴露，背根神经节呈楠圆形米粒般大小，将神经节取出加4%多聚甲醛缓冲液进行常温保存。背根神经节进行包埋、切片、HE染色，最后使用切片扫描仪进行数字扫描成像后观察，描述其主要病理改变，拍摄或截取对应描述中不同的典型病变部位并用箭头标识。

1.7 统计学方法所得数据使用SPSS 19.0统计软件进行正态分布检验，服从正态分布结果以均数±标准差（x±s）表示。组间比较时，若组内服从正态分布，则采用单因素方差分析（One-way ANOVA），检验以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 整体情况造模后的大鼠较造模前对比，精神状态下降，活动量减少，饮食饮水随之减少。各组的大鼠在活动时前肢较正常没有改变，后肢造模后有明显改变，行动方式大多改为爬行为主，速度缓慢，频率及幅度降低。造模后的各组大鼠未发现有后肢瘫痪、步态不稳、足外翻以及大小便失禁的情况。

2.2 后肢热刺激缩痛阈值造模前，各组大鼠后肢热刺激缩痛阈值比较差异无统计学意义（P>0.05）。造模后第3 d，模型组、电针1组和电针2组与造模前对比有差异（P<0.05），提示模型组、电针1组和电针2组造模后热痛刺激缩爪阈值下降，即造模成功;模型组、电针1组和电针2组之间阈值无差异（P>0.05），具有可比性。干预6 d后，电针1组、电针2组的阈值分别与本组造模后3 d的阈值比较，有显著性差别（P<0.05），提示干预6 d后热痛刺激缩痛阈值明显提升，说明大鼠的痛觉的敏感缓解，经干预后大鼠疼痛减轻。见表1。

2.3 血清NPY、SP含量电针干预6 d后，各实验组大鼠血清NPY含量比较，采用单因素方差分析（One-way ANOVA）发现：F=47.05、P<0.0001，组間差异有统计学意义。模型组血清NPY含量均较空白组、电针1组、电针2组升高，且差异具有统计学意义（P<0.05）;电针1组、电针2组血清NPY含量均低于空白组，差异具有统计学意义（P<0.05）;电针1组与电针2组相比，电针1组血清NPY含量低于电针2组，差异具有统计学意义（P<0.05）。各实验组大鼠血清SP含量比较，采用单因素方差分析（One-way ANOVA）发现：F=79.19、P<0.0001，组间差异有统计学意义。与模型组相比，空白组、电针1组、电针2组血清SP含量均降低，且差异具有统计学意义（P<0.05）;与空白组相比，电针1组、电针2组血清SP含量均较低，且差异具有统计学意义（P<0.05）;电针1组血清SP含量低于电针2组，差异具有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.4 背根神经节HE染色光镜观察空白组：大鼠背根神经节结构完整，形态饱满，核位于中央，质均匀，大而圆，核仁清晰，细胞质内充满颗粒状尼氏小体，髓鞘完整，排列规则，轴突清晰（图1-A）。模型组：大鼠细胞出现皱缩、形状不规则，胞质模糊，边界不清，核固缩，尼氏小体减少，神经纤维断裂，髓鞘不完整（图1-B）。电针1组：少量细胞核偏移，核仁大较清晰，髓鞘整体排列规则（图1-C）。电针2组：少量细胞胞质模糊，核仁较清晰，髓鞘整体排列规则（图1-D）。

3 讨论

“梨状二穴”为刘正主任医师根据临床经验自拟创立，包括“梨状肌1”穴和“梨状肌2”穴。梨状肌1穴位于秩边穴直上1寸，与秩边同属足太阳膀胱经;梨状肌2穴位于环跳穴直上0.5寸，与环跳同属足少阳胆经。从解剖位置上看，二穴均在梨状肌肌腹上，深层走行的是从坐骨大孔穿出的坐骨神经。临床治疗发现，针刺此二穴对坐骨神经的刺激作用较“秩边”、“环跳”更强，故采用“梨状二穴”治疗腰椎间盘突出症具有较好疗效。

LDH在中医学上属于“腰腿痛”、“痹证”的范畴，中医学认为其发病主要是由于腰部急、慢性损伤，风寒湿邪侵袭等因素有关，本病病机在于肝肾不足，筋骨不健，复受劳损扭挫，或感风寒湿热之邪，经络闭阻，气滞血瘀，不通则痛[5]。《针灸甲乙经·阴受病发痹第一》云：“腰胁相引痛急，髀筋瘈胫，肱痛不可屈伸，痹不仁，环跳主之。”。《针灸甲乙经·肾小肠受病发腹胀腰痛引背少腹控睾第八》曰：“腰痛骶寒，俯仰急难，阴痛下重，不得小便，秩边主之。”环跳穴、秩边穴为治疗腰椎间盘突出症的常用穴位。“梨状二穴”是临床经验用穴，从解剖位置来看，位于梨状肌肌腹上，深层走行是沿坐骨大孔穿出的坐骨神经，临床运用时针感较上述二穴更强，疗效也颇为显著。

现代医学认为当腰椎间盘纤维环破裂时，即使髓核未直接压迫到神经根，也会出现神经根损伤的临床表现，这是因为机械压迫并不是产生疼痛的主导原因，疼痛的主要发生原因是由于局部的炎症反应所致[6]。本次研究的造模方法用了大鼠的自体髓核混悬液注射到大鼠体内造成非压迫性腰椎间盘突出症大鼠模型，利用腰椎硬膜外穿刺技术，将自体髓核混悬液注入到大鼠腰椎硬膜外腔，髓核基质里的部分蛋白成为抗原，如糖蛋白和韧皮蛋白等，机体组织受到这些抗原的不断刺激，从而引发免疫反应诱发疼痛，这一过程包括了NPY、SP等在内的各种细胞因子和化学因子在内的致炎因子参与[7]。

SP是一种由11个氨基酸组成的多肽，是痛觉传导的神经递质，主要传递锐痛，是非肾上腺素能非胆碱能神经末梢所释放的一种神经肽[8]。SP在中枢神经、外周神经系统和组织中广泛分布，在整个疼痛传递过程中，将疼痛信号由初级神经元传递到次级神经元，在疼痛的产生和发展过程中起着十分关键的作用[9]。李育刚[10]通过研究发现腰椎间盘突出症患者SP含量明显高于健康的人SP含量，而且SP含量与疼痛强度呈正相关。NPY同属于神经肽类物质，广泛存在于中枢和外周神经系统中，研究发现免疫阳性神经纤维广泛分布于椎体、椎间盘、脊柱韧带中，并且在纤维环外层分布最多，参与了椎间盘细胞外基质降解、细胞凋亡与自噬、氧化应激、新生血管生成以及免疫稳态等过程[11]。此外，NPY还可诱导肥大细胞释放5-HT，引起疼痛或加重疼痛[12]。通过本研究结果不难发现，对大鼠进行造模后大鼠血清NPY、SP含量的明显升高，经6 d干预后大鼠血清NPY、SP的含量有所降低，且“梨状二穴”组的大鼠血清NPY、SP的下降程度大于“环跳、秩边”组的大鼠，因此，可以认为“梨状二穴”可以通过调节外周NPY、SP的含量来起到镇痛的作用，且效果优于“环跳、秩边”。

干预6 d后将大鼠的背根神经节进行HE染色，并在光镜下观察发现：模型组细胞出现皱缩、形状不规则，胞质模糊，边界不清，核固缩，尼氏小体减少，神经纤维断裂，髓鞘不完整;运用“梨状二穴”治疗后少量细胞核偏移，核仁大较清晰，髓鞘整体排列规则;运用“环跳、秩边”治疗后少量细胞胞质模糊，核仁较清晰，髓鞘整体排列规则。这表示经过治疗后，电针1组和电针2组神经节内的因髓核的免疫炎症反应导致的病理形态学改变均得到一定程度的恢复。

综合上述的研究结果，可以推测出，大鼠经过硬膜外注射自体髓核后诱发了的自身免疫反应和炎症反应，使得神经节水肿，出现病理性改变，电针“梨状二穴”促进了背根神经节的细胞组织的修复，降低了神经肽致痛因子如NPY、SP在外周的含量，从而减轻炎症反应，降低疼痛程度，消除疼痛症状。本研究初步从外周角度揭示了“梨状二穴”治疗腰椎间盘突出症的机制。本研究因为经费及时间的原因，造模时间及干预时间相对较短，仅能反映LDH发病急性阶段的部分指标变化，后续研究还可从不同的腰痛病类型、不同的理论机制对“梨状二穴”的作用机制进行更为综合性的论证。

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