转录组揭示马卵母细胞体外成熟的重要候选基因

2022-09-29严嘉耕宋新辉吕培茹李志鹏崔奎青王彦涛刘红波刘庆友

中国饲料 2022年14期

严嘉耕，宋新辉，吕培茹，李志鹏，尹珊，崔奎青，王彦涛，刘红波*，刘庆友

（1.广西大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，广西南宁 530004；2.佛山科学技术学院广东省动物分子设计与精细育种重点实验室，广东佛山 528225；3.河南创源生物技术有限公司，河南郑州 451100）

马是一种重要的经济牲畜，不仅为人类健康提供营养优势，还可用于丰富休闲生活。在现代马业中，马匹主要用于赛马、马术、体育娱乐等，具有巨大的社会效益和经济效益。与其他哺乳动物相比，马的生殖生理具有特殊性，如单胎，季节性多次发情，卵巢有排卵窝，没有真正的排卵前LH峰及马卵母细胞的细胞质中含有丰富的脂滴，但缺乏颗粒状内质网、高尔基体和马卵母细胞复合体，且与卵泡壁紧密相连（Metcalf等，2020）。到目前为止，仍没有获得马不同发育阶段卵母细胞的转录谱，导致马卵母细胞的许多关键转录事件尚未确定。本研究拟应用Smart-seq2技术探讨马GV期和IVM MII期卵母细胞基因表达模式，揭示影响马卵母细胞成熟的候选基因及其调控机制。

1 材料与方法

1.1 卵母细胞体外成熟从当地屠宰场收集马新鲜卵巢，置于含25℃生理盐水（含青霉素/链霉素）的保温壶中，在2 h内运送至实验室，按照Hinrichs K等（1993）的方法回收卵丘-卵母细胞复合体（COCs）。在体式显微镜下挑选具有3层以上颗粒细胞且胞质均匀的COCs，转移到每孔含1 mL成熟培养基的四孔板中，在38.5℃、5%CO2、100%湿度的培养箱中培养34 h。

1.2 GV与MII期卵母细胞收集与测序将未成熟和体外成熟的马卵母细胞分为“GV”和“MII”两组，每组3个重复，每个重复10个卵母细胞，转移到裂解缓冲液中。采用Smart-seq2方法建立测序文库，并使用Illumina NovaSeq 6000对文库进行测序，该文库产生具有150 bp（PE150）读取长度的成对末端文库。

1.3 差异表达基因的鉴定 Clean data上传到NCBI Sequence Read Archive（登录号 PRJNA769150）。Clean Reads比对到马基因组（EquCab2）。用DESeq和P值评价GV和MII期卵母细胞基因表达的差异。然后用Cufflinks软件根据FPKM估算该基因的表达水平。以FDR＜0.05且|（Fold Change）| ≥ 1.5作为筛选差异表达基因（DEGs）的标准，并对其进行GO和KEGG分析。

1.4 统计分析试验数值以平均值（Mean）±标准误（SEM）表示，采用SPSS 25.0对数据进行单因素分析和t检验，P＜0.05表示组间差异显著。

2 结果

2.1 马卵母细胞的体外成熟由表1可知，1461个COCs进行体外成熟后，获得了537个MII卵母细胞。MII卵母细胞的发生率显著高于MI卵母细胞（P＜0.05）。

表1 体外培养后不同阶段卵母细胞百分比

2.2 scRNA-seq数据概述获得细胞质均匀的马GV和IVM MII卵母细胞（图1 A），主成分分析（PCA）显示，GV和MII卵母细胞中mRNA的不同表达模式取决于发育阶段（图1 B）。在本研究中，分别在GV和MII卵母细胞中特异性表达了2275和726个基因（图1 C）。共鉴定有9969个基因差异表达，其中5279个基因在GV卵母细胞中高表达，而4690个基因在MII卵母细胞中高表达（图1 D）。

图1 马GV和MII期卵母细胞的转录组分析

2.3 卵母细胞发育过程中的差异表达基因 GV组和MII组前10个注释到的差异表达基因见表2，LGALS3、RAB13等基因在卵母细胞从GV期到MII期的转变过程中异常表达，这些显著差异表达的基因可能参与卵母细胞成熟的分子调控。

表2 Fold Change最高和最低的前10个基因

2.4 GO和KEGG分析由图2可知，DEGs在线粒体、RNA、NADH脱氢酶（泛醌）活性等GO terms上得到显著富集，这说明卵母细胞成熟的过程伴随着线粒体活性的变化。KEGG分析发现，DEGs主要富集在核糖体、细胞周期、氧化磷酸化等相关通路（图3）。

图2 差异表达基因（DEGs）GO富集分析

图3 差异表达基因（DEGs）KEGG富集分析

2.5 qRT-PCR验证由图4可知，母源基因GDF9和BMP15的表达显著下调（P＜0.05），证明了RNA-seq测序结果的准确性和重复性。

图4 母源基因的相对表达量

3 讨论

卵母细胞成熟受卵母细胞中母源mRNA分子网络等多个生物事件调控（Appeltant等，2016），已在猪、黄牛和水牛等哺乳动物中得到广泛研究（Yang等，2017）。与其他哺乳动物一样，在马卵母细胞体外成熟过程中，随着母源基因表达量的下调，如 GDF9和 BMP15（Rong等，2019）。

在上调基因中，LGALS3最显著，可介导人精子-透明带结合，并影响体外受精过程（Mei等，2019）。故我们推测LGALS3对体外受精预备很重要。HERC6属于泛素连接酶HERC家族，在第16天妊娠期比环子宫内膜表达增加。CyclinD2（CCND2）负责卵巢细胞增殖，最突出的作用是调节细胞周期中的G1/S相变，也在卵泡形成过程中对卵丘细胞的增殖起关键作用。TBL3在斑马鱼发育过程中调节细胞周期长度（Hutchinson等，2020）。CDK1（细胞周期蛋白依赖性激酶1）通过调节中心体周期和有丝分裂的开始来调节真核细胞周期。ERK1/2和CDK1的合作和正反馈激活导致小鼠CDK1成熟过程中mRNA翻译和细胞周期进程的微调（Cao等，2020）。但其他基因如RAB13、STC1和PLS3在哺乳动物卵母细胞中研究较少。