转录组揭示马卵母细胞体外成熟的重要候选基因
2022-09-29严嘉耕宋新辉吕培茹李志鹏崔奎青王彦涛刘红波刘庆友
严嘉耕,宋新辉,吕培茹,李志鹏,尹 珊,崔奎青,王彦涛,刘红波*,刘庆友
(1.广西大学 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室,广西南宁 530004;2.佛山科学技术学院 广东省动物分子设计与精细育种重点实验室,广东佛山 528225;3.河南创源生物技术有限公司,河南郑州 451100)
马是一种重要的经济牲畜,不仅为人类健康提供营养优势,还可用于丰富休闲生活。在现代马业中,马匹主要用于赛马、马术、体育娱乐等,具有巨大的社会效益和经济效益。与其他哺乳动物相比,马的生殖生理具有特殊性,如单胎,季节性多次发情,卵巢有排卵窝,没有真正的排卵前LH峰及马卵母细胞的细胞质中含有丰富的脂滴,但缺乏颗粒状内质网、高尔基体和马卵母细胞复合体,且与卵泡壁紧密相连(Metcalf等,2020)。到目前为止,仍没有获得马不同发育阶段卵母细胞的转录谱,导致马卵母细胞的许多关键转录事件尚未确定。本研究拟应用Smart-seq2技术探讨马GV期和IVM MII期卵母细胞基因表达模式,揭示影响马卵母细胞成熟的候选基因及其调控机制。
1 材料与方法
1.1 卵母细胞体外成熟 从当地屠宰场收集马新鲜卵巢,置于含25℃生理盐水(含青霉素/链霉素)的保温壶中,在2 h内运送至实验室,按照Hinrichs K等(1993)的方法回收卵丘-卵母细胞复合体(COCs)。在体式显微镜下挑选具有3层以上颗粒细胞且胞质均匀的COCs,转移到每孔含1 mL成熟培养基的四孔板中,在38.5℃、5%CO2、100%湿度的培养箱中培养34 h。
1.2 GV与MII期卵母细胞收集与测序 将未成熟和体外成熟的马卵母细胞分为“GV”和“MII”两组,每组3个重复,每个重复10个卵母细胞,转移到裂解缓冲液中。采用Smart-seq2方法建立测序文库,并使用Illumina NovaSeq 6000对文库进行测序,该文库产生具有150 bp(PE150)读取长度的成对末端文库。
1.3 差异表达基因的鉴定 Clean data上传到NCBI Sequence Read Archive(登 录 号 PRJNA769150)。Clean Reads比 对 到 马 基 因 组(EquCab2)。 用DESeq和P值评价GV和MII期卵母细胞基因表达的差异。然后用Cufflinks软件根据FPKM估算该基因的表达水平。以FDR<0.05且|(Fold Change)| ≥ 1.5作为筛选差异表达基因(DEGs)的标准,并对其进行GO和KEGG分析。
1.4 统计分析 试验数值以平均值(Mean)±标准误(SEM)表示,采用SPSS 25.0对数据进行单因素分析和t检验,P<0.05表示组间差异显著。
2 结果
2.1 马卵母细胞的体外成熟 由表1可知,1461个COCs进行体外成熟后,获得了537个MII卵母细胞。MII卵母细胞的发生率显著高于MI卵母细胞(P<0.05)。
表1 体外培养后不同阶段卵母细胞百分比
2.2 scRNA-seq数据概述 获得细胞质均匀的马GV和IVM MII卵母细胞(图1 A),主成分分析(PCA)显示,GV和MII卵母细胞中mRNA的不同表达模式取决于发育阶段(图1 B)。在本研究中,分别在GV和MII卵母细胞中特异性表达了2275和726个基因(图1 C)。共鉴定有9969个基因差异表达,其中5279个基因在GV卵母细胞中高表达,而4690个基因在MII卵母细胞中高表达(图1 D)。
图1 马GV和MII期卵母细胞的转录组分析
2.3 卵母细胞发育过程中的差异表达基因 GV组和MII组前10个注释到的差异表达基因见表2,LGALS3、RAB13等基因在卵母细胞从GV期到MII期的转变过程中异常表达,这些显著差异表达的基因可能参与卵母细胞成熟的分子调控。
表2 Fold Change最高和最低的前10个基因
2.4 GO和KEGG分析 由图2可知,DEGs在线粒体、RNA、NADH脱氢酶(泛醌)活性等GO terms上得到显著富集,这说明卵母细胞成熟的过程伴随着线粒体活性的变化。KEGG分析发现,DEGs主要富集在核糖体、细胞周期、氧化磷酸化等相关通路(图3)。
图2 差异表达基因(DEGs)GO富集分析
图3 差异表达基因(DEGs)KEGG富集分析
2.5 qRT-PCR验证 由图4可知,母源基因GDF9和BMP15的表达显著下调(P<0.05),证明了RNA-seq测序结果的准确性和重复性。
图4 母源基因的相对表达量
3 讨论
卵母细胞成熟受卵母细胞中母源mRNA分子网络等多个生物事件调控(Appeltant等,2016),已在猪、黄牛和水牛等哺乳动物中得到广泛研究(Yang等,2017)。与其他哺乳动物一样,在马卵母细胞体外成熟过程中,随着母源基因表达量的下调,如 GDF9和 BMP15(Rong等,2019)。
在上调基因中,LGALS3最显著,可介导人精子-透明带结合,并影响体外受精过程(Mei等,2019)。故我们推测LGALS3对体外受精预备很重要。HERC6属于泛素连接酶HERC家族,在第16天妊娠期比环子宫内膜表达增加。CyclinD2(CCND2)负责卵巢细胞增殖,最突出的作用是调节细胞周期中的G1/S相变,也在卵泡形成过程中对卵丘细胞的增殖起关键作用。TBL3在斑马鱼发育过程中调节细胞周期长度(Hutchinson等,2020)。CDK1(细胞周期蛋白依赖性激酶1)通过调节中心体周期和有丝分裂的开始来调节真核细胞周期。ERK1/2和CDK1的合作和正反馈激活导致小鼠CDK1成熟过程中mRNA翻译和细胞周期进程的微调(Cao等,2020)。但其他基因如RAB13、STC1和PLS3在哺乳动物卵母细胞中研究较少。
4 结论
本研究鉴定了多个影响卵母细胞成熟的候选DEGs,这些候选基因主要与氧化磷酸化、线粒体活性相关。本研究为全面理解卵母细胞成熟过程中mRNAs的表达水平提供了基础,为理解马卵母细胞成熟的分子调控机制,尤其是其中关键基因的潜在调节作用提供了新的线索。