防腐木材中戊唑醇和丙环唑的高效液相色谱分析方法

张景朋，张卿硕，吴玉章，蒋明亮*

(1. 中国林业科学研究院林业新技术研究所，北京 100091； 2. 中国林业科学研究院木材工业研究所，北京 100091)

木材作为一种生物质材料，在使用过程中极易遭受虫蛀以及腐朽菌、霉菌等微生物的侵害[1-2]。木材防腐处理可以延长木材使用寿命5倍左右[3]，是节约木材的重要措施，对木材资源高效利用具有重要意义。木材防腐剂包括铜基、硼基防腐剂，以及有机杀菌剂和天然提取物为主成分的防腐剂[4-6]，目前户外防腐材使用最广泛的为铜基防腐剂和有机防腐剂，市场占有率超过95%。铜唑(CA)是由铜胺络合物和三唑杀菌剂复配而成的一种水载型木材防腐剂，其中三唑药剂是戊唑醇(TEB)和丙环唑(PPZ)[3]，铜唑制剂抗流失性强、防腐防白蚁性能优良[7-8]，处理材野外耐久9年完好[9]，已在我国大量推广应用。戊唑醇和丙环唑(两者简称PT)作为麦角甾醇生物合成抑制剂对担子菌、子囊菌等木材腐朽菌有很好的防治效果[10]，已被列入GB/T 27654—2011《木材防腐剂》和GB/T 27651—2011《防腐木材的使用分类和要求》，室外地上使用载药量在300 g/m3以下，使用成本较低、环境相容性好[8]。

为了保证含PT防腐剂处理木材的质量，建立一种简便、准确分析防腐材中戊唑醇和丙环唑含量的方法非常重要。戊唑醇和丙环唑一般采用高效液相色谱法(HPLC)分析[11]，将戊唑醇和丙环唑从木材中充分抽提是准确分析其含量的关键，Miyauchi等[12]和马红霞等[13]报道了超声波提取木材中戊唑醇的方法，其中木材抽提物的干扰色谱峰通过固相萃取预处理减弱或消除，可实现戊唑醇的准确分析。不同木材的抽提物组成和含量会有差别[14]，抽提物色谱峰的干扰对PT的准确分析影响较大。目前关于防腐木中PT的提取以及HPLC分离分析的研究鲜有报道，仅有GB/T 23229—2009《水载型木材防腐剂分析方法》和GB/T 33021—2016《有机型木材防腐剂分析方法 三唑及苯并咪唑类》公布了关于PT及其处理木材中含量的分析方法，其中关于防腐木分析的前处理用时较长、操作步骤烦琐，对防腐木样品的前处理进行优化研究，可为相关标准修订提供支撑。

在前期PT分析方法[15]研究基础上，笔者重点对超声波提取木材中PT方法的提取溶剂种类、溶剂用量、提取时间进行优化，运用最佳提取方法对辐射松、杉木、杨木、橡胶木和竹材的处理材进行前处理，对处理液采用HPLC进行PT的含量分析，为防腐材中PT的含量分析提供简便快捷的前处理方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

辐射松(Pinusradiata)产地新西兰；杉木(Cunninghamialanceolata)产自湖南省；橡胶木(Heveabrasiliensis)产自海南省乐东县；杨木(Populusspp.)，107品系，产自山东省长青县。选取无明显节子、变色等缺陷的边材制成规格20 mm×20 mm×20 mm(纵向×弦向×径向)的试件。毛竹(Phyllostachysedulis)，竹龄4年，产于浙江省杭州市，刨去竹青、竹黄后的竹条，制成50 mm×20 mm×5 mm(纵向×弦向×径向)的试件。

石油醚、环己烷、丙酮、乙醇，均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；甲醇、乙腈，均为色谱纯，购自美国Thermo-Fisher公司；丙环唑(质量分数≥95%)，褐色黏稠状液体；戊唑醇(质量分数≥97%)，白色粉末，购自温州绿佳农药进出口有限公司；戊唑醇标准品(纯度≥99.5%，甲醇中丙环唑溶液标准物质1 000 mg/L)，购自北京北方伟业计量技术研究院；PT制剂，其中戊唑醇质量分数7.2%、丙环唑质量分数7.4%，由本实验室自制。

1.2 试验方法

1.2.1 色谱条件

根据参考文献[11,16]，结合各种木材的抽提物分离条件，确定如下色谱条件：SilGreen C18色谱柱(长×柱径=250 mm×4.6 mm，填料粒径5 μm，购自北京绿百草科技发展有限公司)；柱温30 ℃；流动相V甲醇∶V乙腈∶V水=1∶1∶1，流速1.2 mL/min；检测波长220 nm；进样量20 μL。

1.2.2 标准溶液配制

称取0.010 0 g戊唑醇标准品于10 mL容量瓶中，加入色谱甲醇定容至刻度得1 000 mg/L标准溶液。分别量取1 000 mg/L的戊唑醇和丙环唑标准溶液各5 mL混合均匀，得到质量浓度均为500 mg/L的PT标准溶液。将上述溶液用甲醇稀释，配得质量浓度梯度为5，20，40，60，80和100 mg/L的PT系列标准溶液，在相同的色谱条件下进样分析，绘制标准曲线。

1.2.3 辐射松试件的防腐处理

称取10.000 g的PT制剂于2.5 L烧杯中，加水至1 000 g稀释得到一定浓度的处理药液。选取无节子、变色等缺陷的辐射松试材，在28 ℃烘箱中，自然气干，含水率为9.2%。称取处理前质量(精确至0.001 g)，将试件放入处理槽中，用重物压稳，注入防腐处理液，置于真空干燥箱中，抽真空至-0.09 MPa，保持15 min，卸压后常压浸泡10 min。处理完毕后取出试件，用滤纸擦去表面残留药液，称取处理后质量(精确至 0.001 g)，在28 ℃烘箱中，自然气干7天，含水率为9.2%。试件中药剂的载药量按如下公式计算：

R0=(m2-m1)c/m1×103

(1)

式中：R0为试件中防腐剂的载药量，mg/g；m1为试件吸药前质量，g；m2为试件吸药后质量，g；c为防腐剂中有效成分的质量分数，%。

图1 PT溶液色谱图Fig. 1 PT solution chromatograms

1.2.4 木竹材样品的制备与分析

1)辐射松分析样品的预处理方法优化：将处理的辐射松锯解成厚5 mm的小试件，用植物粉碎机粉碎过 30目(孔径为0.55 mm)筛。准确称取约0.300 0 g木粉于30 mL螺盖样品瓶中，准确加入体积为V的溶剂，旋紧螺盖，置于超声波清洗器中，保持温度25 ℃，超声提取一定时间。结束后，取上层清液，过孔径为0.45 μm有机滤膜后，用于HPLC分析，每组样品重复3次，取平均值。根据防腐剂的回收率对超声预处理的溶剂种类、溶剂用量、提取时间因素进行优化。试件中防腐剂载药量的测定值按如下公式计算：

R=V×C/(m×103)

(2)

式中：R为试件中防腐剂载药量的测定值，mg/g；V为提取溶剂体积，mL；C为测得的有效成分质量浓度，mg/L；m为木粉的质量，g。

2)5种木竹材样品的制备与分析：将辐射松、杉木、橡胶木、杨木和竹材的素材试件用植物粉碎机制成木粉。准确称取0.300 0 g木粉于30 mL螺盖样品瓶中，用移液枪量取戊唑醇和丙环唑质量浓度为714和734 mg/L的PT溶液1 mL 加入样品瓶中，敞口在自然状态下充分气干得戊唑醇和丙环唑质量载药量分别为2.380和2.447 mg/g的分析样品；使用戊唑醇和丙环唑质量浓度为178.5和183.5 mg/L的PT溶液用同样的方法处理，得到载药量分别为0.595 和0.612 mg/g 的分析样品。采用优化出的超声提取条件进行处理，处理后样品液过孔径为0.45 μm有机滤膜后，用于HPLC分析，每组进行5次重复，计算平均值。

2 结果与分析

2.1 HPLC分析方法的评价

质量浓度约为24 mg/L的PT制剂溶液的色谱图见图1a，色谱图中基线较稳，色谱峰峰形较好，无拖尾，两者分离效果理想。其中戊唑醇保留时间在14.3 min，丙环唑的出峰时间在17.1 min左右，其与GB/T 33021—2016中戊唑醇和丙环唑保留时间相比有所延长，主要原因是本研究所用色谱柱规格不同，且流动相流速较慢所致。丙环唑色谱峰出现分叉是因为对映体的存在。此外，检测防腐木竹材中防腐剂的含量，色谱分析最关键的是实现木材抽提物色谱峰和防腐剂色谱峰的完全分离。采用上述流动相对防腐辐射松抽提后进行液相色谱分析，如图1b所示，辐射松抽提物种类较多，大部分在防腐剂出峰之前已分离出来，在丙环唑出峰后仅有1个小杂峰，抽提物色谱峰对戊唑醇和丙环唑色谱定量分析无干扰。

采用外标法定量分析PT含量，以质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标作图，得戊唑醇(丙环唑)线性相关曲线(图2)。在5～100 mg/L线性范围内：戊唑醇线性方程为y=35.465x+0.349 3，决定系数R2=0.999 7；丙环唑线性方程为y=35.653x-12.660 0，决定系数R2=0.999 7。

图2 戊唑醇和丙环唑的标准曲线Fig. 2 Standard curves of tebuconazole and propiconazole

6份平行试样在相同色谱条件下进行进样分析，精密度结果见表1。其中，戊唑醇的平均含量为7.17%，标准偏差为0.07%，变异系数为0.98%；丙环唑的平均含量为7.45%，标准偏差为0.06%，变异系数为0.83%。戊唑醇和丙环唑的相对标准偏差均非常小，表明平行分析结果之间数据非常接近，分析方法精密度高。

表1 精密度试验结果Table 1 Precision test results

在戊唑醇和丙环唑质量浓度分别为11.970和12.440 mg/L的PT样品中添加一定质量浓度的PT标准品，在相同色谱条件下进行测定，计算回收率，结果见表2。测得戊唑醇和丙环唑的回收率分别为99.0%～101.3%和98.9%～100.8%，表明该方法准确度较高。由此可知，本研究所采用的分析方法标准曲线线性相关性好，精密度及准确度较高，可准确应用于有效成分戊唑醇和丙环唑的含量分析。

表2 准确度试验结果Table 2 Accuracy test results

2.2 防腐辐射松中PT提取方法的优化

取防腐处理后的辐射松木粉，采用不同极性的有机溶剂对PT进行超声提取，测定结果见图3a。结果表明不同溶剂的提取效率不同，石油醚、环己烷和丙酮对戊唑醇的提取效果优于丙环唑，回收率均小于60%，提取效果最差；乙腈、乙醇对戊唑醇和丙环唑的提取效果无差别，但乙腈和乙醇的回收率大约在50%和70%；采用强极性甲醇超声提取戊唑醇和丙环唑的测定载药量与理论载药量一致，能够很准确地提取检测辐射松中PT的含量，优先使用甲醇作为溶提取剂。出现上述差别，可能是因为木材表面有许多极性基团[14]，极性太小的溶剂，会很难渗透到木材内部，难以提取出木材内的药剂。

a)提取溶剂; b)提取溶剂体积; c)液料比; d)超声时间。图3 防腐辐射松中PT提取方法的条件优化Fig. 3 Optimization of conditions for PT extraction method in anti-corrosion Pinus radiata

水在提取中代替甲醇使用具有较高环保和经济价值。在提取木材中的PT时，虽然水的极性最大，最易渗透木材，但PT在水中溶解度较小，很难将木材中的药剂全部溶出，兼顾对木材渗透性和对药剂的溶解性，需将水和甲醇混合。甲醇和水的体积比为9∶1和8∶2时，对辐射松中戊唑醇和丙环唑提取均比较完全，测定载药量与上面采用甲醇提取的结果一致(图3b)，但随着甲醇与水的体积比增大到7∶3之后，对辐射松中戊唑醇和丙环唑的提取率下降到95%左右，在保证测定载药量接近理论载药量前提下，甲醇与水的体积比为8∶2较为合适，推荐为超声提取中的适宜溶剂。

提取分析木材中药剂时，溶剂用量越低越经济，溶剂用量用液料比(溶剂体积与木粉质量之比，mL∶g)表示。用甲醇与水体积比为8∶2的混合液提取辐射松中的PT，不同液料比测定结果如图3c所示。在液料比为10∶1时，戊唑醇和丙环唑的测定载药量分别是1.170和1.262 mg/g，低于实际计算载药量，表明溶剂用量过少，不能将杉木中的PT充分提取出来。随着液料比增大到30∶1及以上时，测定载药量均非常接近理论载药量，后续分析采用30∶1的液料比最为合适。

在上述提取条件下，对辐射松在不同提取时间下的样品溶液进行分析，结果如图3d所示。超声提取10 min时戊唑醇和丙环唑的测定载药量为1.198 和1.265 mg/g，回收率较低；超声提取时间延长到30 min时，戊唑醇和丙环唑的测定载药量均接近各自的理论载药量，可实现辐射松中PT的充分提取，因此从效率和能耗角度考虑，不必将时间延长到60 min或更长，选取超声提取30 min作为最佳提取时间。

综上所述，对防腐辐射松中的PT含量分析时，前处理采用超声波提取法，优化得到的最佳条件为：甲醇和水(体积比8∶2)为溶剂，采用30∶1(mL∶g)的液料比，提取时间30 min。与GB/T 23229—2009和GB/T 33021—2016相比，超声提取的时间缩短至30 min，且超声波提取木材中戊唑醇和丙环唑的前处理方法简化了步骤：处理后的抽提液过滤后直接进行HPLC分析，不需先浓缩至干，再定容的操作。

2.3 提取方法对5种防腐木竹材的处理分析

除辐射松外的其他4种木竹材素材在相同处理条件下抽提物的液相分析在处理之前进行，结果显示抽提物对PT分析均无干扰(图4)。为进一步验证所优化出的防腐木中PT提取方法的可靠性和适用性，在上述优化得到的最佳提取条件下进行前处理，除辐射松外，同时处理和分析了包括杉木、橡胶木、杨木和竹材在内的5种防腐木竹材样品。

图4 杉木、橡胶木、杨木和竹材的提取溶液色谱图Fig. 4 Extraction solution chromatograms of Cunninghamia lanceolata, Hevea brasiliensis, Populus spp and bamboo

5种处理材的测试结果见表3，每个树种2个水平的载药量。结果表明：所有防腐木竹中戊唑醇和丙环唑的回收率分别为95.2%～102.1%和95.9%～104.0%，标准偏差分别为0.7%～3.0% 和 0.3%～2.8%，均在可接受范围。出现回收率大于100%是由于系统误差造成的，如前处理过程中个别样品瓶未能完全密封导致部分溶剂的挥发，会使分析结果偏高。从表3可以看出，对辐射松、杉木、橡胶木和杨木的防腐处理材中PT的含量分析结果均接近实际载药量值。对防腐处理竹材的PT含量分析结果稍低于实际载药量，戊唑醇和丙环唑的回收率在96%左右，可能是因为混合溶剂(甲醇和水)对竹材的渗透性较差，相比于木材提取较慢，在超声处理的30 min内不能将竹材里的药剂全部提取出来，对防腐竹材前处理时可适当延长超声提取时间或改为纯甲醇溶剂提取。对于其他树种防腐木中PT的含量分析也可参照此方法，但需确保抽提物的色谱峰对PT色谱峰无干扰。

表3 5种防腐木竹材的分析结果(n=5)Table 3 Analysis results of five kinds treated wood and bamboo (n=5)

3 结 论

1)采用紫外检测器及C18反相色谱柱，检测戊唑醇和丙环唑的色谱条件：甲醇、乙腈和水(体积比1∶1∶1)为流动相，流速1.2 mL/min，检测波长220 nm；在5～100 mg/L范围内，标准曲线决定系数R2均为0.999 7，线性相关性好，精密度及准确度较高，可用于戊唑醇和丙环唑含量分析。

2)超声波法提取辐射松中戊唑醇和丙环唑，最佳条件为：甲醇和水(体积比8∶2)为溶剂，采用30∶1(mL∶g)的液料比，提取时间30 min。超声波提取木材中戊唑醇和丙环唑的方法溶剂消耗少、提取时间短。

3)最佳提取和色谱条件下，处理分析辐射松、杉木、橡胶木、杨木和竹材5种样品中戊唑醇和丙环唑的回收率分别为95.2%～102.1%和95.9%～104.0%，标准偏差分别为0.7%～3.0%和0.3%～2.8%。该方法可以检测常用防腐处理材中戊唑醇和丙环唑的含量，具有前处理快捷、分析结果重现性好、适用性广的优点，同时提取过程减少了有机溶剂用量。