毫针针刺足三里对佐剂性关节炎大鼠穴区电阻、温度和能量代谢变化的影响*

张 婷，吴永强，王 鼎，陈 波，赖 清，司原成，莫曦雅

(贵州中医药大学针灸推拿学院，贵州 贵阳 550025)

毫针针刺是医者借助毫针在人体特定部位施以一定的手法操作，以防治疾病的一种中医临床外治法，具有疏通经络、调和阴阳、扶正祛邪的作用。现代研究认为针刺疗效受患者生理基础、情志状态、腧穴性质、针刺手法、针具选择等多方面的影响[1]，其中机能状态是针刺疗效发挥的基础[2]。但目前对针刺机理的研究多集中于临床治疗，针刺对穴区局部激活作用的现代医学研究仍较为缺乏。因此，本研究选取电学特性、生物热学特性和能量代谢3方面，探讨佐剂性关节炎(AA)状态下毫针针刺对穴区局部的影响，为毫针针刺的现代生物医学机制提供进一步的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 6～8周龄SPF级健康雄性SD大鼠32只，体质量(200±20)g，由长沙市天勤生物技术有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK(湘)2019-0014。动物饲养于贵州中医药大学动物实验室，室温(22±1)℃，相对湿度(50±5)%，光照12 h明暗交替(明期8：00-20：00)，大鼠自由摄食进水。实验过程中对大鼠的各种处理遵循国家科学技术部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》规定。

1.2 主要试剂与仪器 弗氏完全佐剂(SLBZ9884，美国Sigma-Aldrich)；水合氯醛(1113A20，北京雷根生物技术公司)；大鼠三磷酸腺苷(ATP)/二磷酸腺苷(ADP)ELISA试剂盒(ZK-R4622/ZK-R3711，深圳子科生物科技公司)。

电子天平(WT型，杭州万特衡器公司)；红外体温计(CK-T1503，深圳长坤科技公司)；直流低电阻测试仪(YP2512，深圳永鹏仪器公司)；冻存管(607001，美国NEST)；液氮罐(YDS-20，青岛海尔特种电器公司)；酶标分析仪(Infinite F50，瑞士Tecan)；一次性无菌针灸针(0.30mm×25mm，190102/53，吴江云龙医疗器械公司)。

1.3 动物分组与造模方法 将32只大鼠采用随机数字表法分为正常组与AA组2个大组，每大组16只；各组再按窝别、体重、活跃度因素配对后随机分为非针刺组与针刺组2个小组，每小组8只。AA模型采用CFA造模方法复制[3]：每只大鼠右足跖皮内注射0.1 mL CFA以致炎。继续饲养11 d后完成造模。

1.4 干预方法 各组大鼠称重后，于右侧“足三里”穴周备皮，穴位定位参考《实验针灸学》附录四，定位为：膝关节下外侧，腓骨小头下5 mm。各组大鼠称重备皮后分别用10%水合氯醛行腹腔注射麻醉，麻醉剂量(mL)=大鼠重量(g)×0.3 mL/100g。

针刺组麻醉后消毒右侧“足三里”穴，毫针直刺5 mm，按(60±2)r/min的频率均匀捻针，捻转幅度为180°～360°，捻针5 min，留针10 min，然后再捻针5 min，以此类推，共捻针3次，于第3次捻针完毕后出针，每天1次，共操作3 d。非针刺组麻醉后与针刺组做相同的抓取、固定，不施加其他处理。

1.5 观察指标及检测方法

1.5.1 穴区温度检测 各组大鼠行末次刺激后俯卧位固定，用红外体温计温度探头置于穴区皮肤上3～5 cm处，每隔10 s记录1次温度值，记录1 min，共记录6次，取平均值为穴区温度值。

1.5.2 穴区电阻检测 温度测量后，各组大鼠继续俯卧位固定，以进针点为中心，在直径5mm范围内用75%酒精进行涂擦，无关电极蘸生理盐水后，固定在右侧后肢足掌中，并将蘸少许生理盐水溶液的探测电极分别置于被测穴位进针点和其上下左右各1.5 mm 处共5个点观测电阻，取平均值为穴区电阻值。

1.5.3 ELISA法检测穴区ATP、ADP含量 于第3 d检测完温度、电阻后，将大鼠脱颈处死并立即取材。取材方法为：于大鼠右侧后肢进一步备皮、消毒，切开皮肤后，以大鼠针刺点为圆心，直径约5 mm、垂直深度约5 mm的区域内取穴区皮下组织块约200 mg。组织块取下后用生理盐水冲洗，置入冻存管后于液氮中保存备用。

ELISA法检测组织块ATP、ADP含量：组织匀浆后取上清液作为检测标本，按照试剂盒说明书稀释为6个浓度梯度，稀释后各孔加样量都为50 μL，设空白孔及样品孔。每孔加入酶标试剂100 μL，空白孔除外，并用封板膜封板后置37 ℃温育60 min。配液洗涤，每孔加满洗涤液，静置60 s后弃去，如此重复洗板5 次。显色，加入底物A和B各50 μL，37 ℃避光显色15 min，每孔加终止液50 μL，450 nm波长依序测量各孔的吸光度值，计算样品含量。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况观察 正常组大鼠正常饮食饮水，毛色光泽、大便正常。AA组大鼠与正常组相比，精神萎靡，活动减少，毛发凌乱晦暗，粪便稀溏，有舔舐右后足行为。其造模后18 h，右足肿胀达高峰，持续约3 d后逐渐减轻，造模后8 d再度肿胀，11 d时右侧足爪红肿，右足趾部触痛明显，伴其余三足不同程度红肿，耳廓血管充血，耳部、尾部可见炎性结节，提示造模成功。正常大鼠和AA大鼠针刺后，穴区进针处均可见一暗红色微小圆孔，余穴区局部无红肿等改变。干预后，正常针刺组较正常非针刺组，大鼠一般情况无明显变化。AA针刺组较AA非针刺组，大鼠活动稍增加。

2.2 各组大鼠穴区电阻值比较 正常组、AA组针刺后，穴区电阻值均较各自的非针刺组降低(P<0.01)；但AA组穴区电阻降低幅度较正常组差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 毫针针刺“足三里”对佐剂性关节炎大鼠穴区电阻的影响

2.3 各组大鼠穴区温度值比较 正常组、AA组针刺后，穴区温度值均较各自的非针刺组降低(P<0.01)；且AA组穴区温度降低幅度较正常组大(P<0.01)。见表2。

表2 毫针针刺“足三里”对佐剂性关节炎大鼠穴区温度的影响

2.4 各组大鼠穴区ATP/ADP比值比较 正常针刺组较正常非针刺组，穴区ATP/ADP比值升高(P<0.01)；AA针刺组较正常针刺组，穴区ATP/ADP比值更低(P<0.05)；AA组较正常组，穴区ATP/ADP调节幅度偏小(P<0.01)。见表3。

表3 毫针针刺“足三里”对佐剂性关节炎大鼠穴区ATP/ADP的影响

3 讨论

佐剂性关节炎以多发性关节炎为特征表现，属中医学“痹证”范畴，其主要病机是气虚血瘀、脉络瘀阻[4]。针刺具有镇痛、抗炎、免疫调节等作用[5-6]，能有效控制AA大鼠的关节炎症。《灵枢》有云“著痹不去，久寒不已，卒取其三里为干”，《神灸经纶》言“上中下三部痹痛，足三里”。“足三里”穴作为足阳明胃经的合穴、下合穴，对痹证有着良好的治疗效果，同时是针刺治疗AA疾病时选择频次最高的穴位[7]。

自“良导络”理论提出后，大量学者对人体腧穴的电学特性开展了研究工作，人体穴位存在电阻抗特性和伏安特性，呈现低电阻、高电位特征[8]，这与穴区组织一氧化氮与神经一氧化氮合酶蛋白表达增高和去甲肾上腺素合成与释放的改变相关[9]。针刺可以改变穴区局部表皮角质层与结缔组织形态，改变细胞内液与细胞外液的电解质梯度，从而引起穴位局部的导电性提升、电阻下降[10]。孙艳红等[11]选取60例健康受试者的“足三里”和“上巨虚”穴分别行留针、补法、泻法三种针刺手法，观察到针刺操作后经穴皮肤下电阻抗均降低。周丹等[12]运用原络配穴法和合募配穴法观察手阳明大肠经腧穴针刺后的皮肤电阻，发现针刺后腧穴皮肤电阻值均较针刺前下降。本研究中，针刺正常组、AA组大鼠均可以降低腧穴的电阻值，AA组穴区电阻降低幅度较正常组无显著差异，说明AA状态对毫针针刺的降电阻效应无影响作用。

腧穴的热敏特性以温度为外在表现形式，针刺对穴区的温度具有双向调节作用。李璐等[13]通过比较健康者和脑出血患者“足三里”穴留针期间的穴区体表温度，发现后者穴区升温较前者幅度更低。纪青灼[14]利用医用红外热像仪观察针刺“冲阳”穴对健康者皮肤温度的影响，发现针刺即刻和针刺5 min时穴区温度均较针刺前降低，而针刺5 min至出针前，穴位温度持续上升，针刺15 min后穴区温度较针刺前升高。蒋珞琦[15]对健康受试者“曲池”穴行不同针刺手法，证实了“烧山火”手法可使穴区皮温升高，而“透天凉”手法使穴区皮温降低。本研究中所采取的针刺方法对于大鼠“足三里”穴具有明显降温作用，AA组针刺后穴区温度较非针刺状态降低，且较正常组温度调节幅度更大，说明AA状态对毫针针刺的降温效应有增效作用。

能量释放、转移、存储和利用的过程被称作能量代谢，是细胞维持基础生理活动的基本特征。机体体内各种能源物质氧化所释放的能量，一部分以高能磷酸键为载体贮存于ATP中[16]。1分子ATP和1分子AMP可以催化反应生成2分子ADP[17]，ATP通过与ADP的相互转化，实现了能量的储存和释放[18]。ATP/ADP比值反应能量的代谢水平：ATP生成增多时，ATP/ADP比值升高；ATP水解增多时，ATP/ADP比值下降。针刺能促进穴区局部A3受体拮抗剂、p38MAPK激酶、P-P50和P-P65的表达[19-20]，引起穴区局部能量代谢水平的提高。本研究中，针刺提高了正常组大鼠穴区ATP/ADP，AA组大鼠针刺降低了穴区ATP/ADP，AA状态可明显逆转针刺对腧穴ATP/ADP的增调效应。

综上，毫针针刺能降低穴区局部的电阻与温度，提高穴区局部能量代谢水平。AA状态下毫针针刺激活腧穴的作用与正常机体状态存在不同。AA状态对毫针针刺的降电阻效应无影响作用，对毫针针刺的降温效应有增幅作用，对毫针针刺的ATP/ADP增调效应有逆转作用。针刺对AA的治疗作用除了通过增强腧穴电敏特性达到外，还可能主要通过降低穴区温度和降低能量代谢实现。其它不同机能状态下毫针针刺的局部效应是否存在相同规律，有待于今后进一步的实验研究。