重庆市真菌形态学室间质量评价的建立及运行分析

王淑玲，张 震，徐兰兰，颜 令，廖 璞

重庆市人民医院检验科，重庆 400014

2016年12月9日，原国家卫生和计划生育委员会发布《关于提高二级以上综合医院细菌真菌感染诊疗能力的通知》，要求地方各级卫生行政部门要加强对二级以上综合医院细菌真菌感染诊疗能力建设的指导和监督，不断提高其细菌真菌感染诊疗水平。目前，真菌感染的发生率不断增加，实验室对真菌感染的检测方法主要有直接镜检、微生物培养、血清学实验和分子生物学检测。真菌的检测起步晚，真菌检测大多仍是通过形态学鉴定。感染性疾病的医疗诊治大多基于实验室的检测结果,这些结果可以影响临床诊断治疗。形态学往往是微生物检验人员的薄弱环节,应培养微生物人员学习真菌形态学知识的兴趣,并保证检验质量。基于现状，重庆市临床检验中心率先开展了真菌形态学的室间质量评价(以下简称室间质评)，并在重庆市初步实施，本研究通过对2019—2021年3次室间质评结果的分析，了解重庆市实验室真菌形态学读片能力和存在问题，以更好地为临床服务。

1 材料与方法

1.1真菌菌落图片及镜下形态图片制作 收集临床工作中分离的典型菌株，接种于血平板、沙保罗琼脂培养基(SDA)及马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)，28 ℃或35 ℃培养,培养时间根据真菌生长速度而不同。用相机拍摄菌落形态和染色镜下典型图片，根据真菌特点选择革兰染色、乳酸酚棉兰染色、荧光染色、墨汁染色、生理盐水湿片、六胺银染色或临床标本KOH湿片，低倍镜或高倍镜下拍摄形态图片，图片刻录光盘。

1.2室间质评方法 2019—2021年开展3次室间质评，重庆市临床检验中心每次发放5个样品，重庆市参加室间质评的实验室按照通知信息收到读片并在规定日期前检测和上报。

1.3评价方法 依据《CNAS-GL002：2018能力验证结果的统计处理和能力评价指南》[1]，统计参评实验室对质评标本的测定结果与预期结果的符合程度。真菌读片鉴定种属均正确得20分(部分少见真菌例外)，属正确部分符合得10分，其他不得分。总分≥80分为合格。

1.4统计学处理 采用SPSS20.0软件进行数据处理。计数资料以例数、百分率表示，比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1参加真菌形态学室间质评并上报数据的实验室数和合格率 2019—2021年，参加该项目室间质量评价的实验室数从28家增加至53家，合格率从53.6%增加到94.3%，见表1。

表1 参加真菌形态学室间质评的实验室数和合格率

2.2参加真菌形态学室间质评的实验室构成和合格率 2019—2021年，参加室间质评的实验室主要是综合性二、三级医院的实验室。二级医院实验室合格率由50.0%上升到90.9%。在2019—2021年，三级医院实验室合格率均高于二级医院实验室，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 2019-2021年参加真菌形态学室间质评的实验室构成和合格率

续表2 2019-2021年参加真菌形态学室间质评的实验室构成和合格率

2.3真菌形态学读片结果 2019—2021年共发放15个标本，完全符合率在32.1%～100.0%。实验室对常见真菌读片完全符合率高于少见真菌，如常见烟曲霉复合群完全符合率为92.7%，黑曲霉复合群完全符合率为96.2%；少见的阿萨希毛孢子菌完全符合率为57.1%，镰刀菌属完全符合率为82.1%，木霉属完全符合率为83.0%。见表3。

表3 真菌形态学读片结果

3 讨 论

在真菌病的诊治过程中,病原真菌的鉴定是至关重要的一环,对真菌病的成功治疗具有重要的指导价值。尽管分子生物学真菌鉴定方法具有快捷、精准的特点,但因成本费用所限,普及程度并不高,并且试剂盒之间存在很大差异[2]。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)应用于临床酵母菌菌种鉴定且成效显著,但是由于丝状真菌的蛋白质提取难度大，所以MALDI-TOF MS在丝状真菌鉴定效能及应用程度受到影响[3]。而真菌形态学鉴定方法试剂简单、费用低廉、开展方便，具有诊断的直观性[4],故迄今为止,真菌形态学鉴定方法依然是临床实践中传统可靠的诊断方法，但也是微生物检验人员的薄弱环节。

目前重庆市开展真菌检测并参加真菌形态学室间质评的主要是三级和二级医疗机构实验室，三级医疗机构实验室符合率高于二级医疗机构实验，而二级医疗机构实验室符合率提高比较快。实验室重视程度和人员学习积极性在增加。

真菌形态学鉴定通过观察真菌在培养基上的生长速度、颜色和菌落质地，借助显微镜观察菌丝结构和孢子发生来鉴定真菌[5]。重庆市临床检验中心从2019年开始建立并逐步完善真菌形态学室间质评体系，2019—2021年3次室间质评图片覆盖了10个菌属，涉及了酵母菌、酵母样菌和丝状真菌。每种菌提供典型菌落形态(提供培养信息)、显微镜下典型特征和经典染色图片。真菌形态学室间质评考核了分枝分隔的透明菌丝；宽大、无隔、透明菌丝及暗色菌丝；瓶梗产孢的曲霉、木霉；孢子囊产孢的根霉；孔出产孢的链格孢属；环痕产孢的尖端赛多孢菌；关节孢子的阿萨希毛孢子菌和大、小分生孢子的须癣毛癣菌。而对这些形态的认知能力是临床微生物实验室真菌检测能力建设的基本要求[6]。实验室人员对常见真菌的读片能力好于少见真菌。隐球菌引起的肺炎和脑膜炎，临床表现差异大及缺乏特异性，预后差，病死率高，需要检验科提供快速、准确的结果。临床标本中经典染色方法为墨汁负染，原始标本革兰染色也可看到宽大、不着色荚膜区。对新型隐球菌读片的第1次(201921号)完全符合率为32.1%，重庆市临床检验中心根据反馈结果采取相应的措施，第2次(202024号)发放隐球菌，完全符合率为100.0%。曲霉菌是实验室分离最多的丝状真菌，各实验室对常见烟曲霉复合群(202022号)和黑曲霉复合群(202123号)的读片完全符合率高，分别为92.7%和96.2%，土曲霉复合群(202023号)完全符合率为87.8%，少见的杂色曲霉复合群(201922号)完全符合率仅为35.7%。曲霉镜下鉴别点主要是通过菌落形态和分生孢子头结构加以区别[7]。我国是农业大国，植物性外伤是发生真菌性角膜炎的主要因素，镰刀菌属是真菌性角膜感染的最常见病原菌[8]。角膜刮取物涂片可查见菌丝，可根据培养菌落颜色、大小分生孢子形态、厚壁孢子有无进行种间鉴别，部分镜下难以区分时需要进行测序鉴定。2次发放茄病镰刀复合群，完全符合率由82.1%升到100.0%。201923号标本目标真菌为阿萨希毛孢子菌，有16家实验室回报正确，另外有11家实验室回报热带念珠菌。阿萨希毛孢子菌属于毛孢子菌属，是一种条件致病菌，为酵母样真菌，可引起免疫缺陷患者各种机会性感染，镜下结构非常丰富[9-10]。阿萨希毛孢子菌和热带念珠菌在CHROMagar 念珠菌显色培养基上均显蓝色，但热带念珠菌革兰染色镜下只有芽生孢子和假菌丝，而阿萨希毛孢子菌可见真、假菌丝和芽生、关节孢子，可用于区分这两种真菌。

临床检测工作中，建立质量控制已是常态，但真菌形态学还没有制订标准。重庆市临床检验中心3次发放真菌形态学图片，微生物人员开始重视对真菌形态的学习，各实验室之间一致性和正确性逐渐提高。另外，微生物人员应加强对少见真菌的学习，这样才能更好地服务临床，这也是室间质评的目的所在。