液态有机肥部分替代化肥对设施番茄根区细菌群落的影响

夏秀波， 李涛， 曹守军， 姚建刚， 王虹云， 张丽莉

（山东省烟台市农业科学研究院，山东 烟台 265500）

化肥能够提供作物所需的氮、磷、钾、钙、镁、硫、铁、锰、铜、锌、硼、钼等矿质元素，具有养分浓度高、肥效快的特点，极大地丰富了农业生产系统中的养分供应，提高土壤肥力，使作物增产55%～65%[1]。随着化肥的使用，养分搭配不合理、施用方式粗放、施用过量等带来了一系列问题，如土壤板结、盐渍化、有益微生物减少、作物产量降低、品质下降等[2]。施用有机肥有利于改善土壤理化性质[3]，改良土壤微生物种群结构[4-5]，提高土壤肥力及作物产量，改善品质[6-7]。但传统固态有机肥的施用存在劳动强度大、效率低、肥效慢等特点。相比固态有机肥，液态有机肥具有施用便捷、肥效快速、效率高等优点。目前，液态有机肥在大田作物上研究较多[8-11]，在蔬菜作物上较少[12]，主要集中在对土壤理化性质、作物产量品质以及光合特性等方面。相比化肥，液态有机肥养分种类多，功能多样，因而液态有机肥与化肥配施能够提高肥料利用率，改善土壤，促进植株的生长发育，提升作物产量和品质[13-14]。但液态有机肥对于土壤微环境影响的研究较少，尤其对土壤微生物菌落结构影响的研究尚未见报道。本研究将液态有机肥按不同比例部分替代化学冲施肥，研究不同处理下设施番茄根区细菌菌群的组成结构、多样性，以期为设施番茄生产中液态有机肥与化肥的合理配施提供理论依据。

1 材料与方法

试验于2019年7月—2020年3月在山东省烟台市农业科学研究院日光温室内进行。土壤类型为壤土，pH 7.6，有机质60.0 g·kg-1，水解氮430 mg·kg-1，有效磷318.1 mg·kg-1，速效钾1 660 mg·kg-1。

1.1 试验材料

番茄品种为烟粉209，由山东省烟台市农业科学研究院提供，种植密度为42 450 棵·hm-2。化学冲施肥为康晶（N:11%；P:11%；K:35%），由荷兰雅苒集团出品；液态有机肥为新壮态植物生长促进液（腐植酸≥30 g·L-1，N+P2O5+K2O≥200 g·L-1），由山东民和公司生产。

1.2 试验处理

试验以全部采用化学冲施肥为对照（T_CK），然后设置3个处理，分别为处理1：液态有机肥替代20%化学冲施肥（T_R20）；处理2：液态有机肥替代30%化学冲施肥（T_R30）；处理3：液态有机肥替代40%化学冲施肥（T_R40）。每处理3个重复，采用随机区组试验，小区面积3.9 m2。分别于9月6日、9月27日、10月11日、10月26日和11月22日进行追肥，具体用量详见表1。其他栽培措施按照常规管理进行。

表1 不同处理的施肥量Table 1 Fertilization amount of different treatments

1.3 根区土取样和样品高通量测序

各处理均于拉秧前在番茄植株根区5—10 cm、土层深度10—15 cm 处，采用取土器分别取样，每个处理3次重复。所有样品在-20 ℃保存备用，用于提取基因组DNA。高通量测序工作由上海美吉生物医药科技有限公司完成。

1.4 DNA 抽提和 PCR 扩增

土壤微生物群落总DNA 抽提按照E.Z.N.A.®soil DNA ki（tOmega Bio-tek,Norcross,GA,U.S.）说明书进行；DNA 的提取质量采用1%的琼脂糖凝胶电泳检测；DNA 浓度和纯度采用NanoDrop 2000 测定。对16S rRNAV3～V4 可变区的 PCR 扩增 引 物 采 用338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）[8]。

1.5 Illumina Miseq 测序

使用Illumina 公司的Miseq PE300/NovaSeq PE250 平台进行测序，具体步骤参照刘森等[15]的方法。

1.6 数据处理

使用fastp 软件对原始测序序列进行质控[16]，使用FLASH 软件进行拼接[17]，具体参照刘森等[15]的方法。采用UPARSE 软件[18]依据97%的相似度对序列OTU（operational taxonomic unit）聚类和剔除嵌合体[18-19]。利用RDP classifier 进行序列的物种分类注释[20]，并设定70%阈值对Silva 16S rRNA数据库（v138）进行比对。

Alpha 多样性常用指数采用mothur（version v.1.30.1）软件，具体算法如下。

①Chao 指数：用chao1 算法估计样本中所含OTU数目的指数。

式中，Schao1为估计的 OTU 数；Sobs为实际观测到的 OTU 数；n1为只含有1条序列的 OTU 数目；n2为只含有两条序列的OTU数目。

②Ace 指数：用来估计群落中OTU 数目的指数(SACE)。

式中，CACE是样本覆盖度的估计值是稀有物种的变异系数；ni为含有i条序列的OTU 数目；Srare为含有“abund”条序列或者少于“abund”的OTU 数目；Sabund为多于“abund”条序列的 OTU 数目；abund为“优势”OTU的阈值，默认为10。

③Simpson指数：用来估算样本中细菌多样性的指数(Dsimpson)。

其中，Sobs为实际观测到的OTU 数目；ni为第i个OTU所含的序列数；N为所有的序列数。

④Shannon指数：用来估算样本中细菌多样性的指数。Shannon值越大，群落多样性越高。

式中，Sobs为实际观测到的OTU数目；ni为第i个OTU所含的序列数；N为所有的序列数。

⑤Coverage：是指各样本文库的覆盖率，其数值越高，则样本中序列被测出的概率越高。

式中，n1为只含有1条序列的OTU 数目；N为抽样中出现的总序列数目。

2 结果与分析

2.1 测序样本数据统计

对4个处理土壤样本的细菌进行高通量测序分析，共获得有效序列251 559 条，有效碱基数目105 152 207 bp，序列平均长度为 418 bp。4个处理样本的具体序列个数、碱基数、平均序列长度、最短序列长度、最长序列长度详见表2。按照97% 相似度，共产生 1个域，1个界，37个门，104个纲，268个目，441个科，730个属，1 401个种，3 747个OTU（operational taxonomic units）。

表2 样本信息统计表Table 2 Sample information statistics chart

2.2 稀释性曲线分析

由图1 可知，随着序列数量的增加，4个土壤样本的Sobs 指数曲线最终呈现平缓，表明测序数据量已经很大，能够反映出各个处理样本中大部分的细菌多样性信息，测序数据量合理。

图1 细菌的Sobs稀释曲线Fig.1 Rarefaction Sobs curves of OTU numbers

2.3 多样性分析

T_CK、T_R20、T_R30 和 T_R40 处理样本细菌的覆盖度分别为0.991 6、0.990 5、0.989 5和0.992 0，表明测序基本涵盖了所有OTU，测序结果能够反映样本细菌的真实状况。各处理样本细菌的Alpha 多样性指数如表3 所示。T_R30 处理样本的Ace 指数和Chao 指数最高，分别为3 081.20 和3 064.07，其次为 T_CK 和 T_R40，T_R20 最低，处理间均存在显著差异。T_CK 样本的Shannon 指数最高，T_R30和T_R20次之，且处理间差异不显著；T_R40 最低，显著低于其余处理。T_R40 处理样本的Simpson 指数最高，显著高于其余处理；T_R30 次之；T_R20 和对照 T_CK 较低，显著低于其余处理。各处理样本的Sobs 指数表现为T_R30、T_CK＞T_R40＞T_R20。综上所述，测序基本覆盖了所有OTU，以T_R30 处理样本细菌的丰富度和多样性较高。

表3 样本细菌多样性指数Table 3 Diversity index of Bacteria in samples

2.4 细菌群落组成相关分析

由图2 可知，4个处理样品中共有OTU 值为1 338，占各样品总OTU 的比例分别为49.67%（T_CK）、54.81%（T_R20）、49.17%（T_R30）和52.59%（T_R40）。T_CK、T_R20、T_R30 和 T_R40处理样品中独有的OTU 值分别为118、140、129和263，占各样品总OTU 的比例分别为4.38%、5.74%、4.74%和10.34%。由此表明，液态有机肥部分替代化肥显著增加了细菌种类。

图2 细菌OUT分布水平上的Venn图Fig.2 Venn map of the level of bacteria OTU distribution

2.5 细菌群落组成分析

2.5.1 基于门（phylum）水平 各处理样本的细菌群落在门水平的分布如图3所示，共获得13个类群。在对照样本（T_CK）中，优势菌门分别为变形菌门（Proteobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、酸杆菌门（Acidobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、Patescibacteria、浮霉菌门（Planctomycetes）和匿杆菌门（Latescibacteria），共占95.81%。在T_R20样本中，优势菌门分别为绿弯菌门（Chloroflexi）、变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、Patescibacteria和异常球菌-栖热菌门（Deinococcus-Thermus），共占95.79%。在T_R30 样本中，优势菌门分别为变形菌门（Proteobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、酸杆菌门（Acidobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、Patescibacteria、浮霉菌门（Planctomycetes）、Rokubacteria和Latescibacteria（匿杆菌门），共占96.02%。在T_R40样本中，优势菌门分别为变形菌门（Proteobacteria）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、绿弯菌门（Chloroflexi）、酸杆菌门（Acidobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、Patescibacteria、浮 霉 菌 门（Planctomycetes）、Rokubacteria 和硝化螺旋菌门（Nitrospirae），共占97.00%。

图3 门水平各样本中细菌群落组成Fig.3 Composition of bacterial community on Phylum level

2.5.2 基于属（genus）水平 各处理样本中细菌在属水平上的分布如图4 所示，共获得42个属。在对照样本（T_CK）中，优势菌属分别为norank_c_subgroup_6、芽 孢 杆 菌 属（Bacillus）、norank_f_A4b、芽 单 胞 菌 属 （norank_f_Gemmatimonadceae） 、norank_o_SBR1031和norank_o_Saccharimonadales，共 占 31.21%。 在T_R20 样本中，优势菌属分别为芽孢杆菌属（Bacillus)、norank_c_subgroup_6、norank_f_JG30 -KF-CM45、norank_o_Actinomarinales、norank_c_JG30-KF-CM66、Paenisporosarcina、norank_f_A4b、芽单胞菌 属 （norank_f_Gemmatimonadceae） 、norank_o_SBR1031和norank_c_Gemmatimonadetes，共 占34.61%。在T_R30 样本中，优势菌属分别为norank_c_subgroup_6、芽孢杆菌属（Bacillus）、假单胞菌属（norank_f_A4b、Pseudomonas）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、norank_c_JG30-KF-CM66、norank_c_Gemmatimonadetes和RB41，共占 32.63%。在T_R40 样本中，优势菌属分别为芽单胞菌属（norank_f_Gemmatimonadceae） 、芽 孢 杆 菌 属（Bacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、norank_f_A4 b、norank_c_subgroup_6和norank_f_TRA3-20，共占27.81%。

图4 属水平各样品中细菌群落组成Fig.4 Composition of bacterial community on Genus level

2.6 样本比较和物种差异分析

2.6.1 聚类分析 采用距离矩阵进行样本层级聚类分析，结果（图5）表明，细菌群落按照样本间的距离可以划分为3个不同的类群，T_CK 和T_R30样本为1个类群，T_R40 和T_R20 样本分别为单独的类群。

图5 不同样本细菌群落OTU水平层级聚类树系图Fig.5 Hierarchical clustering tree of bacteria on OTU level

2.6.2 主成分分析 通过基于欧氏距离的PCA分析，共提取出2个主成分，贡献率分别为76.05%和20.48%。4个处理样本细菌的群落组成差异如图6 所示，T_CK、T_R20、T_R30、T_R40 处理样本的细菌群落组成存在明显差异。其中，T_CK 和T_R30 距离最近，且在1个区，说明2个样本细菌的菌落组成相似度较高；T_R20 和T_R40 样本细菌的菌落组成差异较大。

图6 细菌群落OTU水平主成分分析Fig.6 Principal component analysis of bacteria on OTU level

2.6.3 非度量多维度分析 对4个土壤样本细菌群落进行非度量多维尺度(non-metric multidimensional scaling，NMDS)分析，结果（图7）显示，Stress 值为0，表明数据有很好的代表性。不同处理样本的细菌群落在NMDS1 维度和NMDS2 维度能够很好地被区分开，其中，T_CK 和T_R30 处理样本在图中距离较近，说明二者样本细菌菌落组成相似度高；其他样本的细菌菌群之间存在明显差异。

图7 基于相似性＞97%的OTU 水平上细菌非度量多维度分析Fig.7 NMDS plot of bacteria on OTU level based on similarity ＞97%

2.7 共现性网络分析

在属水平上，对4个土壤处理样本细菌群落的共性与丰度进行比较，结果（图8）表明，仅T_CK和T_R30样本细菌群落的共性较大，其余样本间共性较少。

图8 细菌群落在属水平的网络分析Fig.8 Network analysis of bacteria on Genus level

2.8 功能预测分析

利用PICRUSt软件对土壤样本细菌群落功能组成进行预测，结果（图9）表明，4个处理样本细菌的主要COG功能组成相似，但各COG相对丰度存在差异。

图9 细菌群落的COG功能分类和相对丰度Fig.9 COG function classification and relative abundance of bacteria

3 讨论

土壤生态系统存在着数量庞大的微生物种群，细菌和真菌是这个种群中重要的组成部分。它们参与土壤中物质和能量循环，对于土壤生态系统的稳定、养分的利用、土传病害的调控和土壤健康的保持具有重要意义[21-22]。

3.1 液态有机肥替代化学冲施肥对设施土壤细菌多样性的影响

研究表明，人为向土壤中大量施入外源物质不仅导致土壤生态系统稳定性发生变化，还导致土壤细菌群落多样性降低[23]。但也有研究认为，土壤微生物通常具有比较稳定的多样性特征，短期土壤培肥对土壤微生物无显著影响[24]。本研究发现，随着液态有机肥替代化学冲施肥比例的增加，土壤微生物的Shannon 指数有所降低，但Simpson指数有所升高，说明土壤微生物的多样性虽然有所降低，但差异不显著；而土壤微生物的Ace 指数和Chao 指数先升高后降低，表明土壤的细菌丰度先升高后降低，与前人研究结果相一致[3,25-26]；且液态有机肥不同比例替代化学冲施肥增加了土壤细菌的种类，改变了菌落的丰富度、多样性和组成。不同处理比较发现，液态有机肥替代化学冲施肥以30%比例时土壤细菌的丰富度、Ace和Chao指数均较高。

3.2 液态有机肥替代化学冲施肥对设施土壤细菌菌落结构的影响

本研究通过统计学的分析方法对不同处理样本进行分析发现，随着液态有机肥替代化学冲施肥比例的增加，各处理样本的主要优势菌组成在门、属水平上基本相似，但相对丰度存在一定差异。施用化学冲施肥时处理样本中的优势菌门主要为变形菌门（Proteobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、酸杆菌门（Acidobacteria）；随着液体有机肥替代化学冲施肥比例的增加，设施土壤中优势菌在原有3 种细菌的基础上增加了厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes），且丰度值发生了明显的变化，与前人研究结果基本一致[27-29]。土壤细菌丰度值的变化可能是由于施入液态有机肥后，有机肥中的微生物菌群与土壤微生物群落间存在营养竞争作用。变形菌门（Proteobacteria）能够促进氮肥的利用，增强植物病虫害防治、土壤修复和复杂污染物降解等能力；绿弯菌门（Chloroflexi）可利用3-羟基丙酸途径固定CO2产生能量[30]；酸杆菌门（Acidobacteria）和放线菌门（Actinobacteria）能够促进动植物体降解[31]；芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）的芽孢杆菌属（Bacillus）和假单胞杆菌属（Pseudomonassp）具有抑制植物病原菌、促进作物营养吸收和生长的作用[32-33］。综上所述，液态有机肥与化肥配施有利于提高肥料利用率、促进作物生长、改善土壤微环境、保持土壤的可持续利用。但随着液态有机肥部分替代化肥施用年限的增加，土壤微环境的变化及作用效果有待于进一步研究。