制作高质量小鼠胃组织石蜡切片的方法优化

李 璐 李汝佳 李 琛 朱少平

（1.广东医科大学基础医学院组织学与胚胎学教研室，广东 湛江 524023；2.广东医科大学基础医学院病理教研室，广东 湛江 524023；3.广东医科大学附属医院检验科，广东 湛江 524001；4.广东医科大学实验动物中心实验动物学教研室，广东 湛江 524023）

0 引言

胃（stomach）呈囊状膨大，空虚时呈收缩状态，内面可见纵行的皱襞。进食后，由于肌组织舒张，胃腔扩张，皱襞消失，可暂时贮存食物。由于胃组织结构致密层次多，有较强的柔韧性和硬度，在制作高质量的石蜡切片过程中常见腺体结构不完整，黏膜各层次间隙大组织结构不清晰，平滑肌层肌束分离以及皱襞收缩脆裂较严重等现象。笔者在工作中通过多次试验有效解决了这些问题，通过在制片方法上进行一些改进，获得了良好的成像效果。采用健康C57BL/6小鼠胃部组织进行实验操作（其和人类的胃在层次结构和组织学特点上都相似），Heidenhain Susa固定液固定，切片时蜡带直接展片，最后四氢呋喃透明、脱蜡，苏木素染色液和伊红染液滴染。改进后的胃组织切片最大限度保持与活体组织相近的完整结构，核质着色均匀，制片时间缩短，值得推广，现报道如下。

1 材料

1.1 实验动物

购买健康C57BL/6小鼠30只，3月龄，体质量量30 g士3.5g，雌雄各半，北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号SCXK（京）2019-0008。小鼠随机分为对照组，实验组和常规组，每组各10只。

1.2 实验试剂和仪器

Heidenhain Susa固定液（氯化汞4.5 g，氯化钠0.5 g，三氯醋酸2 g，蒸馏水8Oml，37%甲醛溶液20m1，冰醋酸4 m1），放置于棕色试剂瓶内。10%福尔马林溶液（30%甲醛10ml，蒸馏水90ml）。0.5%盐酸乙醇液（浓盐酸0.5 ml，70%乙醇溶液100 m1）。四氢呋喃分析纯AR（成都科隆化学品有限公司）。苏木精染色液，伊红染液，环保型浸蜡脱蜡透明液，环保封片胶，购自北京索莱宝科技有限公司，高效切片石蜡（上海华永石蜡有限公司），粘附载玻片（25×75mm）（江苏世泰实验器材有限公司）。Leica RM2245电动进样切片机，DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）。

2 方法

2.1 取材

小鼠禁食4h，2.5%戊巴比妥腹腔注射麻醉，蒸馏水浸湿小鼠胸部、腹部皮毛，将小鼠仰卧于解剖盘，解剖剪剪开腹腔，在胃贲门处和幽门处用止血钳夹住，小解剖剪剪下整个胃，剪尖向上沿着胃小弯剪开，生理盐水洗去胃内的残存食物。

2.2 固定

在对照组A和实验组B中，采用连续摆动超声震荡处理，震荡频率90次/min，将小鼠胃组织迅速放入Susa固定液中固定10h，待组织完全固定后，直接进行脱水。常规组C不采用振荡处理，10%福尔马林溶液常规固定10 h，固定后的胃组织置于广口瓶内，瓶口用纱布缠绕包扎，将瓶子放置于自来水管下方，流水缓慢地由水龙头经胶皮管注入瓶内进行冲洗，水量以组织块在水中稍有移动为准。

2.3 脱水与透明

对照组A和实验组B均无水洗，对照组A，放入95%乙醇液中脱水1h，用环保型透明液常规方法透明，实验组B，放入95%乙醇溶液：四氢呋喃1∶1混合液1h、四氢呋喃1h，投入四氢呋喃-石蜡1∶2混合液（石蜡熔点6O℃）30 min。常规组C，采用常规脱水方法：70%乙醇溶液、80%乙醇溶液、90%乙醇、95%乙醇溶液、100%乙醇溶液，每级各2h，环保型透明液透明0.5h。见表1。

表1 脱水与透明不同时间点比较

2.4 浸蜡与包埋

完全透明后的胃组织标本放置于石蜡I（熔点48℃～55℃）1.5h，石蜡II（55℃～60℃）1h，石蜡包埋（58℃～60℃）。对照组A和实验组B置于6O℃恒温震荡仪中连续摆动震荡，震荡频率120次/min。浸蜡时用预热的小镊子分别将对照组A、实验组B和常规组C的胃组织放入包埋框内包埋。常规组浸蜡时不使用震荡处理。

2.5 切片

对照组A和实验组B，Leica RM2245电动进样切片机，莱卡一次性刀片，切片刀的刀刃与蜡块竖直平面之间夹角为5°，胃组织切片厚度4微米（μm），蜡带分别裱在粘附载玻片上。将切片放置在60℃的电热恒温培养箱内进行展片，10min后胃组织自然展开贴附于载玻片上，烤箱内干燥2h。常规组C常规切片，水浴展片，摊片机水温40℃借助水温和水的张力，组织蜡带平展后，用解剖小镊子将石蜡切片一个个分开裱在粘附载玻片上，控去粘附载玻片上的水分，放入烤箱内干燥2h。通过对比，对照组A，实验组B和常规组C三者组织切片形态结构基本相同，而相比于传统水浴展片法，采用石蜡直接展片法大大缩短了展片时间。

2.6 染色

载玻片倾斜20°角放人立式染色缸中，对照组A使用环保型脱蜡液脱蜡、实验组B使用四氢呋喃分析纯AR浸泡10min脱蜡，对照组A和实验组B组，梯度乙醇水化至下行70%乙醇溶液，蒸馏水浸洗3 min，苏木精染液滴染15min，自来水洗去浮色，1%盐酸乙醇溶液分色2S，0.5氨水（pH值7.5）蓝化30S，自来水水洗，光镜下观察细胞核的分色质量，流水冲洗10min，伊红染液染胞质30S，90、95、100%梯度乙醇速洗，每级乙醇各3min，四氢呋喃分析AR透明、环保封片胶封片。此过程除水洗和蓝化在室温下进行，其余步骤放置在56℃恒温震荡仪中，震荡速度95次／min进行。常规组C采用常规方法染色，染色过程中不使用恒温振荡仪振荡，环保型脱蜡液脱蜡，透明。

2.7 判断标准合格标准

低倍镜下完整呈现黏膜各层（见图2）。不合格标准：低倍镜下不能完整呈现黏膜各层或黏膜腺体呈圆环状横切面外观（见图5，图6）。

2.8 统计学分析

采用SPSS18.0软件对数据进行统计学分析，组间比较采用秩和检验分析。＞0.05，差异无统计学意义；＜0.05，差异有统计学意义。

3 结果

用LEICA Q550IW图像分析系统对小鼠胃组织石蜡切片染色结果进行显微镜下观察（染色结果见图1～图6）。

3.1 总体结果

对照组A和实验组B，优质片84张（70%）、中等片36张（30%）、无次等片及不合格片；对照组无优质片，中等片12张（20.04%），次等片28张（46.71%），不合格片20张（33.33%）。实验组B切片，结构完整程度好，着色优于对照组A。见表2。

表2 各组制片等级结果比较

3.2 染色效果

实验组，第1组（图1、图3）和第2组（图2、图4）。图1，肉眼观察，胃外部形态完整，腔面高低不平，蓝紫色为黏膜，外表层较平滑。蓝紫色黏膜层靠近腔面，表面高低不平形成胃小区，粉色为胃壁其他结构。图2，低倍镜观察，①黏膜，②黏膜下层，③肌层；图3，图4高倍镜观察，箭头①上皮，箭头②胃小凹，箭头③胃底腺，箭头④主细胞，位于腺体部和底部，呈蓝紫色柱状形，细胞核为圆形，箭头⑤壁细胞体较大，呈圆形或三角形，细胞质染成红色，位于细胞中央圆形的细胞核，有时在一个细胞中可见双核。

图1 肉眼观察

图2 胃底（4×10）

图3 胃黏膜层（10×10）

图4 胃黏膜层（40×10）

对照组（见图5，见图6），图5，低倍镜观察，腺体结构模糊、黏膜各层次组织结构不清晰、层次间隙过大，平滑肌层肌束分离以及收缩皱褶脆裂较严重。图6，高倍镜观察，核质染色模糊不清晰。

图5 胃底（4×10）

图6 胃黏膜层（40×10）

4 讨论

由于胃组织结构致密层次多，有较强的柔韧性和硬度，在石蜡切片制作过程中常见各层组织结构不清晰、层次间隙过大，平滑肌层肌束分离以及收缩皱褶脆裂等现象。我们采用改良Heidenhain Susa固定液在组织固定后，无需流水冲洗，直接投入95%乙醇溶液，进行固定，可以大大缩短标本处理时间。

本实验对固定、脱水、透明这三个步骤进行了改良，对照组，实验组，常规组。对照组，使用Heidenhain Susa固定液固定、直接投入95%乙醇溶液脱水、环保型透明液透明，与常规实验相比较，缩短实验时间、透明效果较好。实验组在进行固定、脱水、透明的步骤更改时，（即使用Heidenhain Susa固定液固定、无需水洗直接投入95%乙醇溶液脱水、四氢呋喃分析AR透明），缩短实验时间，透明效果较好、组织无破碎、核质染色均匀。对照组和实验组使用蜡带展片，相对与常规实验切片更平坦、清晰。

Susa固定液能迅速均匀的浸透组织标本内部，渗透力强，收缩硬化小，完整的保存细胞内部结构。固定时，进行超声震荡，因为将固定剂中的标本处于一定的震荡频率下，标本表面所形成的层流就会被破坏而表现为湍流状态，相对增加固定剂对标本的渗透速度。超声震荡、恒温控制技术可以促使胃组织及有机溶剂或预熔石蜡高速震荡，出现周期性的缩张活动，以有机溶剂代替组织内水分，并促使预熔石蜡浸入组织内时间缩短，最大限度控制固定、脱水、浸蜡等操作时间，缩短标本制作的时间。四氢呋喃具有脱水透明的效果，使组织收缩程度小，整块组织不用切割修整直接包埋。乙醇是常用的脱水、脱脂剂，乙醇分子中的极性基团羟基（-OH）可以与组织细胞内的水形成氢键将水置换出来从而起到脱水作用。组织脱水应逐步进行，顺序颠倒会影响脱水效果；在无水乙醇中不可以放置时间太长，会引起组织过硬，使切片的时候组织破碎；更换脱水剂时，浸泡时间需减去吸水过程中所耽误的时间，以免脱水不足；脱水必须在有盖的玻璃瓶中进行，防止吸收空气中的水分和酒精挥发，保证脱水彻底。标本脱水时振荡对脱水时间的确定也有影响，振荡可促进标本固定。

浸蜡期间更换一至两次新蜡液，可以彻底去除透明剂成分，保证标本浸蜡的质量。此过程操作动作要迅速，因为容器内的液体石蜡容易凝固，相对缩短浸蜡时间，半凝固的石蜡不具备置换透明剂和浸透标本的作用。注意包埋框的内面应干净平滑，边缘没有向内凸起的棱角，不要使蜡液凝固，用半凝固的石蜡进行标本包埋，石蜡内部会产生许多小气泡影响石蜡对组织结构的支撑性。蜡带直接展片无需在生物组织摊片机中水展片使蜡带组织在水中更容易破损。染色时使用单独滴染（HE染色），试剂不重复使用，保证每张切片都使用新鲜试剂。每张切片染色时采用滴染式操作，与传统的浸染式操作相比，避免了标本与试剂之间相互污染。同时，保证了染色效果的均一性，无传统染色中染色到后期深浅不一的现象。

综上，经过结合Heidenhain Susa固定液固定、四氢呋喃透明和蜡带展片，既可缩短实验时间，也避免人为因素和其他因素，提高了快速石蜡切片的质量稳定性，有利于快速石蜡切片的质量控制工作。