基于UPLC-Q-TOF-MS结合网络药理学的闽南炮制陈皮活性成分及潜在靶点研究*

陈育青 王小平 余瑞铭 郑晓艳 林汉钦 何丽珊

(1.漳州卫生职业学院药学系,福建 漳州 363000;2.福建中医药大学附属漳州市中医院药剂科,福建 漳州 36300)

陈皮始载于《神农本草经》，为芸香科植物橘CitrusreticulataBlanco及其栽培变种的干燥成熟果皮,具有燥湿化痰，理气健脾的功效,是临床常用于调理中枢气机和治疗咳嗽痰多的药食同源的药物[1]。现代研究表明陈皮具有抗炎、抗癌、抗氧化、降血脂等功效，还具有解痉平喘、稀化痰液的作用[2]。“饮片入药，生熟异用”是中医临床的用药特点，不同炮制方法对中药药性和药效产生着不同的影响。在福建闽南地区收载有一种四制陈皮，炮制技术独特。本课题前期通过查阅大量文献并进行相关实验发现[3，4],较之陈皮生品，闽南四制陈皮可引药入肝、下焦，且温而不燥，不仅增强其理气开胃、降气化痰作用，同时兼具舒肝解郁之功。但因闽南四制陈皮作为地方特色饮片品种，其炮制工艺仅靠药工口传心授传承，并未建立饮片质量标准，导致了饮片质量的不可控，限制了在全国范围的推广使用。因此，明确闽南特色炮制陈皮中的主要成分与作用靶点对阐述其药效物质基础和分子作用机制具有重要意义。

超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS)技术目前已被广泛应用于中药化学成分的快速鉴定，将液质联用技术扫描的碎片离子信息和化合物裂解规律与对照品或参考文献比对，可快速、准确地分析中药中所含化学成分。网络药理学利用复杂的网络模型构建药物、靶点与疾病间的相互作用关系网，阐述中药的多成分-多靶点-多途径作用关系，可预测化学成分作用的靶点和揭示中药成分复杂的作用机制。本实验采用UPLC-Q-TOF-MS技术对闽南炮制陈皮的黄酮类成分进行鉴定，并利用网络药理学分析显著差异成分相关的主要作用靶点和通路，构建“成分-靶点-通路”网络关系，为建立闽南特色炮制陈皮的质量标准奠定基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Thermo Vanquish UHPLC超高效液相色谱仪(美国Thermo Fisher公司)；Q-Exactive HF高分辨质谱仪(美国Thermo Fisher公司)。

1.2 材料 生陈皮(批号19070101)由江西樟树成方中药饮片有限公司提供，经王小平教授鉴定为芸香科植物橘CitrusreticulataBlanco及其栽培变种的干燥成熟果皮。对照品柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮素、柚皮素、川陈皮素、橘皮素购自成都曼斯特生物科技有限公司，批号分别为(MUST-20041803、MUST-20031701、MUST-20041707、MUST-20083014、MUST-20032406、MUST-20041210、MUST-20072310，质量分数均≥98%)。甲醇、乙腈为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 供试液及对照品溶液制备

2.1.1 闽南炮制陈皮的制备 参照《漳州市常用中药加工炮制法》中“四制陈皮”炮制方法制备。按每100 kg陈皮配甘草5 kg，生姜5 kg，食盐5 kg和醋5 kg，4味辅料煎汤去渣，投入净陈皮熬至药汤吸尽为度，捞起晒干即成[3]。

2.1.2UPLC-Q-TOF-MS供试品溶液的制备 取制陈皮适量，粉碎过60目筛，称取粉末约0.5 g，加甲醇50 mL，置于超声波清洗机中超声提取30 min，取出后4000 r/min(离心半径13.5 cm)条件下离心15 min，取上清液，0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.1.3UPLC-Q-TOF-MS对照品溶液的制备 分别精密称取柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮素、柚皮素、川陈皮素、橘皮素对照品各5 mg，加入甲醇稀释后，即得各对照品溶液。将对照品溶液放置于4000 r/min条件下离心15 min，并以0.22 μm微孔滤膜滤过，供UPLC-Q-TOF-MS分析。

2.2 分析条件

2.2.1 色谱条件 安捷伦Zorbax Eclipse C18色谱柱(100 m×2.1 mm，1.8μm)，柱温为30℃；流速为0.3 mL/min,进样量2 μL。流动相为0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)。梯度洗脱(0～2 min：5%B，2～6 min：5%B→30%B，6～7 min:30%B，7～12 min：30%B→78%B，12～14 min:78%B，14～17 min：78%B→95%B，17～20 min:95%B，20～21 min：95%B→5%B，21～25 min：5%B)

2.2.2 质谱条件 ESI离子源，在正、负离子模式下采集数据。质谱扫描范围在100～1500 m/z，扫描速度为1000 Da/s；离子喷雾电压3.50 kV；毛细管温度(离子传输管)330 ℃；加热器温度325 ℃；一级MS扫描的分辨率设置为120 000，二级MS/MS扫描的分辨率为60 000；标准化碰撞能量(NCE)12.5、25和35 eV。

2.3UPLC-Q-TOF-MS分析 采用UPLC-Q-TOF-MS技术对闽南炮制陈皮中的黄酮类成分进行定性分析，通过一级和二级质谱信息，并结合对照品的保留时间和相关文献[5-8]，共鉴定和表征出18个化学成分(见表1)。同时基于我们前期研究[4]，采用t检验的P值和差异倍数(Fold Change)相结合的方法筛选出其中差异显著且表达上调的代谢物共4个，依Log2 Fold Change值大小依次为橘红素、川陈皮素、橙皮素、橙皮苷。

表1 UPLC-Q-TOF-MS鉴别所得闽南炮制陈皮中的化学成分信息

2.4 差异化合物的作用靶标及网络预测

2.4.1 化合物-靶点作用网络的构建 将鉴定得到的4个差异代谢物的Smiles结构导入Swiss Target Prediction数据库，得到成分化合物的预测靶点412个。利用Cytoscape软件绘制蛋白关系，构建化合物-靶点作用网络图(见图1)。靶点网络含有228个节点，长方形蓝色节点代表靶点，菱形红色节点代表黄酮类差异代谢物，边则代表化合物与靶点的相互作用关系。依据相关参数：度、紧密度大小，确定了网络中的6个关键核心靶标：AKT1、VEGFA、CASP3、EGFR、SRC、ESR1。

图1 差异化合物-靶点作用网络图

2.4.2 关键靶点的通路富集分析 利用DAVID平台对PPI网络中涉及的41个核心靶点进行GO功能富集分析。根据设定Bonferroni校正P<0.01，经Kappa算法进一步确定了26个GO条目(见图2)。其中生物过程主要涉及蛋白质自身磷酸化、氧化还原过程、细胞增殖的正向调控、凋亡过程的负调控等方面；分子功能主要涉及ATP结合、蛋白激酶活性、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性等方面；细胞组成主要涉及质膜、细胞溶质、细胞外的外来体、细胞外空隙、原生质膜的组成部分等方面。表明陈皮的有效成分可能通过作用于这些信号通路来达到治疗疾病目的。在KEGG数据库中获得与关键靶点相关通路82条，按照显著性程度展示前20条信号通路。结果表明炮制陈皮可能主要通过癌症通路、PI3K-Akt自噬信号通路、黏着斑、RAS信号通路、氮代谢通路、VEGF信号通路等信号通路协调发挥作用。

图2 KEGG 富集分析气泡图

3 讨论

中药具有多成分、多靶点、多途径协同作用的特点，单一成分或者少数几个成分无法全面反映中药的质量。2015年版《中华人民共和国药典》仅仅将橙皮苷作为陈皮含量测定的指标性成分，无法实现陈皮质量的精准评价。本研究采用UPLC-Q-TOF-MS技术对闽南特色炮制陈皮中的黄酮类成分进行深入分析，同时筛选出炮制前后4个差异代谢物：橘红素、川陈皮素、橙皮素、橙皮苷。李丽等[9]研究发现，橙皮苷和橙皮素可抑制许多由化学致癌剂引起的肿瘤的形成和发展，且抗癌谱较广，涉及肺癌、乳腺癌、肝癌等。其抗癌机制并非直接杀死肿瘤细胞，而是借助于抗氧化、保护基因、抗炎和诱导肿瘤细胞的凋亡等实现。韦金红等[10]研究发现川陈皮素对多种肿瘤细胞都有抑制作用,其抗肿瘤机制是通过抑制肿瘤细胞的生长增殖、迁移和侵袭，诱导肿瘤细胞凋亡，调节肿瘤细胞周期和蛋白表达来实现。

网络药理学从整体的角度探索药物与疾病间的关联性，强调从“单靶标”向“网络靶标”研究模式的转变，很大程度反映了中药多组分在分子水平的协同作用。GO功能富集和KEGG通路富集分析提示炮制陈皮多数的基因富集到了与癌症有直接关系的通路上，包括癌症通路、PI3K-Akt自噬信号通路、黏着斑、氮代谢通路、VEGF信号通路等。另一部分主要是炎性通路，包括TNF信号通路、HIF-1信号通路等。在化合物-靶点网络中，AKT1、VEGFA为关键靶点。AKT1是调节细胞存活和增殖的重要基因，可调节肿瘤的增殖、转移、侵袭[11，12]。VEGFA是糖基化的有丝分裂原，该基因在许多肿瘤中也被上调，其表达与肿瘤发展相关，并且是许多正在开发的癌症治疗中的靶标。同时该基因的等位变体与糖尿病和动脉粥样硬化的微血管并发症有关[13]。

闽南炮制陈皮的炮制目的是引药入肝，增强疏肝解郁止咳之功，通过代谢组学研究进一步证实了闽南炮制陈皮的炮制机制。KEGG富集结果均涉及癌症和炎症通路。中医认为肿瘤的发生与“气结”“痰饮”关系密切[14]。本课题组在前期研究中已证实[4]，陈皮生品经闽南特色方法炮制后，橙皮苷和橙皮素含量均高于其他炮制品种，说明此炮制技术科学有效，为后续质量标准的建立提供依据，同时对保护和传承闽南地区传统炮制技术具有深远的意义。