固相萃取-液相色谱-串联质谱法同时测定饲料中链霉素、双氢链霉素、卡那霉素和安普霉素残留

栾枫婷 龚 兰 王 冉 朱 磊 何 涛 魏瑞成

（江苏省农业科学院农产品质量安全与营养研究所，江苏省食品质量安全重点实验室－省部共建国家重点实验室培育基地，南京 210014）

氨基糖苷类药物（Aminoglycosides，AGs）是由氨基糖分子和苷元通过醚键连接而成，主要分为天然和半合成两类。其中，链霉素、双氢链霉素、卡那霉素和安普霉素均是在链霉菌属培养液中提取获得的，属于天然来源的AGs。AGs易在细菌的核糖体中与蛋白体结合，对细菌蛋白质合成起抑制作用，并且破坏细胞膜的完整性，从而杀灭细菌或抑制其生长[1]。上述4种AGs具有杀菌活性强、临床疗效好、广谱抗菌性等特点，被广泛用于畜牧养殖业。但为维护我国动物源性食品安全和公共卫生安全，农业农村部在发布的第194号公告中规定，自2020年7月起禁止抗菌类药物作为饲料添加剂使用。因此，饲料中添加氨基糖苷类等药物属于违禁行为。双氢链霉素和链霉素有相同的母体结构，当侧链基团是－CH2OH时为双氢链霉素，是－CHO时为链霉素。安普霉素为单组分药物。卡那霉素主要有A、B、C 3种组分，B的耳毒性和肾毒性比A高1～1.5倍，国内外是将B作为杂质进行控制，市售产品中卡那霉素A的含量占95%以上，B的含量则控制在5%内，C含量极少。因此，监测饲料中卡那霉素违禁添加时，实际测定卡那霉素A。

AGs是高度极性化合物，以多离子形式存在于水溶液，很难实现萃取或预浓缩，且该类药物相互作用小，在传统的反相色谱柱滞留量小。因此，开发AGs的分析方法具有挑战性[2]。目前，对饲料中AGs残留检测方法主要有微生物法、离子色谱法和高效液相色谱法等。美国分析化学家协会的AOAC 973.81、AOAC 971.49和AOAC 998.02标 准 采 用微生物法分别测定了饲料中大观霉素、链霉素、新霉素，但该方法操作繁琐、灵敏度低、重现性差，仅适用于定性实验[3]。LIU等[4]、ZHOU等[5]采用高效液相色谱法测定饲料中的AGs，因AGs分子结构缺少紫外和荧光吸收基团[6]，待测样品需进行柱前或柱后衍生化，操作繁琐，易造成目标物损失，导致测定结果偏低。近年来，液相色谱－串联质谱法因定量准确、灵敏度高、抗背景干扰力强且无需衍生化等优点被广泛应用[7]。目前，饲料检测的方法标准或文献报道了在流动相中加入离子对试剂（如七氟丁酸、庚烷磺酸钠等）[6，8～11]，使目标物易于在反向色谱柱上保留，但离子对试剂对质谱负离子模式的抑制作用极大地限制了方法的应用，如何在多残留测定的液相色谱－串联质谱法中规避使用离子对试剂是测定方法开发面临的关键难题。本文避免使用离子对试剂，通过优化前处理过程和色谱分析条件，研究建立同时测定饲料中链霉素、双氢链霉素、卡那霉素和安普霉素残留的固相萃取－液相色谱－串联质谱法，旨在为农业农村主管部门安全监管饲料中氨基糖苷类药物残留提供方法支持。

一、材料与方法

（一）仪器LC－20A液相色谱仪（日本岛津公司）；Triple QuadTM6500+三重四极杆串联质谱仪（美国AB SCIEX公司）；ME104E型电子分析天平（瑞士Mettler－Toledo公司）；VORTEX 3型涡旋混匀器（德国IKA公司）；5810R型高速冷冻离心机（美国Eppendorf公司）；KQ－500E型超声波清洗机（昆山超声波仪器有限公司）；N－EVAP－24型氮吹仪（美国Organomation公司）。

（二）材料与试剂Oasis HLB固相萃取（Solid phase extraction，SPE）柱 （500 mg/6 mL，美国Waters公司）；异丙醇（色谱级，德国Merck公司）；乙腈和甲醇 （色谱级，美国Honeywell公司）；甲酸和乙酸铵（色谱级，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；磷酸二氢钾、乙二胺四乙酸二钠、纯氨水、三氯乙酸和甲醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；链霉素、双氢链霉素、卡那霉素和安普霉素标准品（纯度≥92%，德国Dr.Ehrenstorfer公司）。

（三）实验方法

1.样品提取。准确称取2 g样品于50 mL离心管内，准确加入30 mL 10%三氯乙酸溶液（含0.002 mol/L EDTA－2Na、0.01 mol/L磷酸二氢钾，pH为7.5±0.2），涡旋混匀，超声提取15 min，振荡5 min，以10 000 r/min离心10 min。准确移取15 mL上清液于另一50 mL离心管内，用氨水调节pH至6.5±0.1，作为备用液。

2.样品净化。HLB固相萃取柱预先用5 mL甲醇、水活化，取备用液全部过柱，用水和10%甲醇水溶液各5 mL依次淋洗，抽干。准确加入5.0 mL甲酸－异丙醇－0.002 mol/L乙酸铵水溶液（10∶5∶85，体积比，pH 0.8）洗脱并收集，涡旋混匀后，经0.22 μm滤膜过滤后，供液相色谱－串联质谱仪测定。

3.仪器条件。色谱条件：色谱柱为ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），柱温为35℃，流速为0.3 mL/min，进样量为4 μL。流动相A为1%甲酸，流动相B为含1%甲酸的乙腈，均含0.002 mol/L乙酸铵，梯度洗脱程序为0～2.5 min，20%A；2.6～4.0 min，20%A→65%A；4.1～5.5 min，65%A→90%A；5.6～6.7 min，90%A；6.8～7.5 min，90%A→20%A；7.6～12.0 min，回到20%A的初始条件。

质谱条件：电喷雾离子源正离子模式（ESI+），气帘气压力为206.8 kPa，碰撞气压力为55.2 kPa，离子源电压为5 500 V，离子源温度为550℃，雾化气压力为448.2 kPa，辅助加热气压力为413.7 kPa，扫描方式为多反应监测模式，质谱参数见表1。

表1 4种AGs的质谱参数

二、结果与讨论

（一）色谱柱的选择AGs含有氨基等碱性基团，水溶性较大，C18色谱柱为反相色谱柱，目标药物保留较弱。有文献报道在流动相中加入离子对试剂可实现对该类药物的分离，如张静等[8]和刘清颖[6]在流动相中添加0.02～0.05 mol/L七氟丁酸溶液测定AGs，王钦钦[9]在样品溶液中加入1%七氟丁酸溶液测定AGs，均通过加入离子对试剂增强了目标物在反向色谱柱上的保留。但离子对试剂的使用会严重抑制质谱仪的电喷雾离子化效果，大幅降低仪器灵敏度，尤其是对负离子模式的影响更为明显。因此，为了规避离子对试剂在质谱方法中的使用，本研究考察了OSAKA SODA SILICA、SiELC Obelisc R、BEH C18、HSS T3、BEH HILIC和BEH Amide等色谱柱对4种氨基糖苷类药物的分离效果。结果表明，在没有加入离子对试剂情况下，BEH Amide和Obelisc R色谱柱可对目标物进行分离洗脱，色谱峰和保留时间均符合要求，但Obelisc R色谱柱对醇敏感，影响色谱柱的活性，微量醇试剂会造成目标物峰形拖尾，对仪器管路系统要求严格[12～13]。BEH C18、HSS T3、OSAKA SODA SILICA、BEH HILIC色谱柱对目标物保留时间短、杂质干扰大。因此，最终选择使用BEH Amide色谱柱。

（二）提取条件的优化

1.提取液的优化。本研究选取富含多种矿物元素及微量元素等成分的猪预混合饲料优化提取溶剂。比较了提取液的不同组成和pH对4种药物回收率的影响，通过EDTA－2Na、三氯乙酸、pH 3因素交叉试验，确定提取液组成为10%三氯乙酸、2 mmol/L EDTA－2Na、10 mmol/L磷酸二氢钾，pH为7.5±0.2，此条件下4种药物的回收率约80%，满足要求（见图1）。提取液中的EDTA－2Na可螯合金属离子减少对目标药物的影响[14]，其螯合能力受提取液pH影响。磷酸二氢钾起到稳定溶液酸碱度的作用，而三氯乙酸溶液可沉降样品中的蛋白质，起到样品净化作用。

图1 提取液的不同组成和pH对猪预混合饲料中4种AGs回收率的影响 （添加水平为0.5 mg/kg）

2.不同提取液体积和提取时间的优化。分别选择10、20、30、40 mL提取液进行样品提取，当提取液体积为10 mL和20 mL时上清液少，不利于移取；当提取液体积为30 mL和40 mL时4种药物回收率增加不明显（见图2）。从节约试剂角度考虑，将样品提取液体积定为30 mL。之后进一步比较了不同超声提取时间（5、10、15、20 min）对4种药物回收率的影响，结果发现超声15 min后目标药物的回收率无明显增加（见图2），为节约操作时间，将样品超声提取时间定为15 min。

图2 提取液体积及时间对猪预混合饲料中4种AGs回收率的影响 （添加水平为0.5 mg/kg）

（三）净化条件的优化

1.不同SPE柱的选择。AGs属于极性较强的碱性化合物，为增加目标物在SPE柱填料上的保留，张静等[8]在固相萃取过程中添加0.02 mol/L七氟丁酸溶液。本研究为简化净化步骤，避免使用离子对试剂，比较了WCX（150 mg/6 mL）、MCX（500 mg/6 mL）和HLB（500 mg/6 mL）3种不同类型的SPE柱对4种药物回收率的影响，结果见图3。结果表明，WCX柱（150 mg/6 mL）和MCX柱（500 mg/6 mL）对链霉素和双氢链霉素基本无保留，HLB柱（500 mg/6 mL）对4种AGs保留稳定，回收率为65.1%～87.9%。因此，选择HLB柱（500 mg/6 mL）作为净化SPE柱。

2.过柱备用液pH的优化。过SPE柱的备用液中目标物的离子化程度将影响SPE柱填料对目标物的吸附率。由于精料补充料、配合饲料、浓缩饲料和预混合饲料4种饲料配料之间存在差异，本研究分别选取4种不同饲料，对比pH为3.5、4.5、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.5的过柱备用液对各饲料中4种AGs固相萃取效率的影响。结果表明，pH对配合饲料、浓缩饲料和预混合饲料3种饲料基质中目标物的固相萃取效率影响不大，添加回收率均在70.5%～100.1%范围内。精料补充料与其他3种饲料相比干物质含量高，精料补充料中4种AGs回收率仅在过柱备用液pH为6.5时在90.5%～100.4%之间（见图4），该回收率范围满足检测要求。因此，选择pH为6.5±0.1作为过柱备用液的pH。与蔡春燕等[15]开发的方法相比，本方法可同时满足精料补充料、配合饲料、浓缩饲料和预混合饲料4种饲料的测定。

图4 精料补充料中4种AGs在不同过柱备用液pH条件下的添加回收率（添加水平为0.5 mg/kg）

3.SPE柱洗脱液的优化。异丙醇极性较强，在酸性溶液中加入一定浓度异丙醇可提高4种AGs在HLB柱（500 mg/6 mL）上的洗脱效果。本研究比较了5%异丙醇、甲酸－异丙醇－水（10∶10∶80，体积比）和甲酸－异丙醇－水（10∶5∶85，体积比）3种洗脱溶液的洗脱效率，发现甲酸－异丙醇－水（10∶5∶85，体积比）组洗脱溶液的效果明显高于其他两种，饲料中4种AGs回收率均在65%以上（见图5）。

图5 不同洗脱液组成对饲料中4种AGs回收率的影响（添加水平为0.5 mg/kg）

洗脱液中含有较高的水分，采用氮气吹干将影响处理效率，本研究将洗脱后溶液直接上机测定以简化前处理过程，提高分析效率。由于pH对目标物的响应值和安普霉素色谱峰峰形影响较大，分别比 较 了 洗 脱 液pH为0.8、1.2、1.6、2.0时4种AGs的色谱峰分离效果及峰形情况（预先添加0.002 mol/L乙酸铵稳定洗脱液pH）。结果发现，当洗脱液pH为0.8时，目标物响应值和安普霉素色谱峰峰形显著改善（见图6）。

图6 不同洗脱液pH条件下安普霉素特征离子色谱图对比

4.不同厂家HLB固相萃取柱的适用性研究。为进一步研究固相萃取净化效果的稳定性，本研究选取StrataTM－X（500 mg/6 mL）、Oasis HLB（500 mg/6 mL）、Copure HLB（500 mg/6 mL）、Poly－Sery HLB（500 mg/6 mL）等亲水－亲脂固相萃取柱净化，以基质匹配标准溶液进行结果校正，考察不同厂家固相萃取柱的净化效果，结果发现，各固相萃取柱的回收率和重现性普遍较好，说明不同厂家的固相萃取柱对4种AGs的净化效果差异不明显，均适用于本方法。

（四）方法学考察

1.方法的基质效应评价。饲料产品种类繁多且本底复杂，含有丰富的蛋白质、纤维素、脂肪、维生素等，ESI离子源易受到上述物质干扰[16]，产生基质效应（Matrix effect，ME）。一般以基质匹配标准曲线的斜率（A）和溶剂标准曲线的斜率（B）的比值评估基质效应，若ME值为0.8～1.2，则表明基质效应不明显[17]。本研究按照实验方法制备10、20、50、100、250、500、1 000 ng/mL溶剂标准溶液，以及配合饲料、浓缩饲料、精料补充料、预混合饲料的空白基质标准溶液来评估饲料的基质效应。结果表明，4种AGs在上述饲料中均存在一定的基质增强效应，ME值为1.0～2.4。为消除基质效应带来的定量偏差，采用基质混合标准工作液进行定量。

2.方法的线性范围、检出限和定量限。选取配合饲料、浓缩饲料、精料补充料和预混合饲料4种空白饲料样品，按前处理方法得到空白基质溶液，配制4种AGs的10、20、50、100、250、500、1 000 μg/L基质匹配标准系列溶液，以定量离子的峰面积和相应的质量浓度求出线性方程和相关系数（r），结果见表2。结果表明，4种药物在10～1 000 μg/L质量浓度范围内线性关系良好，相关系数（r）为0.995 9～0.999 9，特征离子色谱图见图7。用空白饲料制备0.05、0.1、0.2、0.3 mg/kg添加样品，处理后测定，分别选取3倍和10倍信噪比为方法的检出限（LOD）和定量限（LOQ）[17]。计算得出，方法的LOD和LOQ分别为0.05 mg/kg和0.1 mg/kg。

表2 基质匹配标准曲线的线性方程和相关系数

图7 猪配合饲料基质匹配标准溶液（20 μg/L）中4种AGs的多反应监测色谱图

3.方法的回收率和精密度。添加低、中、高浓度目标物至配合饲料、浓缩饲料、精料补充料和预混合饲料空白样品，考察加标回收率，每种添加水平做6次重复，连做3 d。结果表明，4种AGs的平均回收率均在69.8%～101.7%范围内，批间和批内的相对标准偏差（RSD）均小于15%（见表3）。

表3 4种AGs在饲料样品中不同添加水平下的回收率和精密度 （n＝6）

4.实际样品测定。根据所建立的测定方法，对采自养殖场的20份饲料样品（配合饲料、浓缩饲料、精料补充料和预混合饲料）进行检测。结果显示，20份样品中4种AGs均低于检出限，该结果表明所收集的饲料均未检出阳性，也同时反映出禁抗政策得到很好的实施。

三、结论

本研究采用固相萃取法结合液相色谱－串联质谱技术，建立了配合饲料、浓缩饲料、精料补充料、预混合饲料中链霉素、双氢链霉素、卡那霉素和安普霉素残留的定量测定方法。为了规避使用离子对试剂和获得较高的目标物回收率，对色谱柱、提取条件、净化条件等参数进行了优化。最终确定饲料样品经10%三氯乙酸溶液（含0.002 mol/L EDTA－2Na、0.01 mol/L磷酸二氢钾，pH为7.5±0.2）提取，HLB柱净化，采用液相色谱－串联质谱测定。4种药物的检出限为0.05 mg/kg，定量限为0.1 mg/kg，平均回收率均在69.8%～101.7%范围内，批内和批间相对标准偏差均小于15%。该方法简便、快速、准确、灵敏，无离子对试剂干扰，可用于饲料中链霉素、双氢链霉素、卡那霉素和安普霉素的测定，为饲料质量安全监管提供了重要的技术手段。