类风湿关节炎患者外周血CD4+T细胞亚群水平检测临床意义

王 悦，金 洋

(湖北医药学院附属太和医院 1.检验科；2.核医学科，湖北 十堰442000)

类风湿关节炎(RA)患者若不接受规范化治疗，大部分会出现全身多关节骨质破坏，导致功能丧失，甚至可致残[1]。研究显示[2]，关节病已成为女性致残者的首要致残疾病，并且RA致残占其中的79.4%，给家庭和社会造成了极大负担。目前，RA的发病机制仍未完全明确。一直以来，免疫系统异常被认为是介导RA发病的重要机制[3]。有研究发现[4]，CD4+T细胞在风湿性疾病患者中表达异常，可能参与了风湿性疾病的免疫病理过程，这可能成为风湿性疾病治疗的重要靶点。其中调节性T细胞与效应性T细胞可相互调节，它们的动态平衡对于机体免疫稳态的维持有着重要作用，二者在感染性疾病中的研究较多[5-6]。本研究对RA患者外周血CD4+T细胞亚群水平进行检测，分析CD4+T细胞亚群水平与疾病活动度的关系，探讨其临床检测意义。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2020年6月—2021年6月本院收治的RA患者70例，其中男19例，女51例，年龄41-72(60.51±10.23)岁。详细记录患者C反应蛋白(CRP)、红细胞沉降率(ESR)、抗环瓜氨酸多肽抗体(CCP抗体)及DAS28评分等临床资料。入组患者均符合2010年美国风湿病学会(ACR)制定的诊断标准[7]，均存在不同程度病情活动，近3个月内无激素使用史；并排除合并其他自身免疫性疾病，严重心肝肾功能不全，合并其他风湿免疫系统疾病，合并急慢性感染，伴恶性肿瘤等。同时根据DAS28评分[8]将RA患者分为轻度活动期组(2.6≤DAS28<3.2，n=21)、中度活动期组(3.2≤DAS28<5.1，n=26)和重度活动期组(DAS28≥5.1，n=23)。另选取性别、年龄与RA组相匹配的健康体检者50名作为对照组，其中男20例，女30例，年龄40-70(47.68±8.69)岁。两组性别、年龄对比差异无统计学意义(P>0.05)。本研究获得本院伦理委员会批准，入组对象均签署知情同意书。

1.2 仪器与试剂

叠氮碘化丙啶刺激剂PMA(美国Sigma公司)，高尔基阻断剂(美国Sigma公司)，磷酸盐缓冲液(北京中杉金桥生物技术有限公司)，离子霉素(联科生物)，1640液体(美国Sigma公司)；溶血素(美国BD公司)，Trucount(美国BD公司)，单克隆抗体CD4-异硫氰酸荧光素TITC(美国BD公司)，低温离心机(北京医用离心厂)，Calibur流式细胞仪(美国BD公司)等。

1.3 外周血CD4+T细胞亚群水平的测定

(1)细胞培养、标记：采集80 μl抗凝血，依次予以PMA(30 ng/ml)10 μl、离子霉素(750 ng/ml)10 μl、高尔基阻断剂1 μl添加，于CO2培养箱37℃下刺激5 h。将细胞分装于一号、二号两管中，予以CD4-FITC加入，于避光环境下，室温孵育30 min，添加Permaeabilization/Fixation液1 ml，经涡旋混匀后，孵育30 min，然后一号管予以IL-4-PE和IFN-γ-APC加入，二号管予以人抗人IL-17-PE加入，室温下孵育30 min。(2)CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的标记：采集 80 μl抗凝血，予以CD25-APC、CD4-FITC加入，避光，室温孵育30 min，予以Permaeabilization/Fixation液1ml加入，经涡旋混匀后，在4℃环境下孵育30 min，予以Foxp3抗体加入，室温孵育30 min，采用PBS进行洗涤，然后上机检测。(3)流式细胞仪检测：采用流式细胞仪检测Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞和调节性T细胞，并计算Th17/调节性T细胞比值。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 RA患者与健康对照组外周血CD4+T细胞亚群水平比较

相比健康对照组，RA患者外周血调节性T细胞水平显著降低，Th17/调节性T细胞比值显著增高，差异有统计学意义(P<0.05)；两组Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 RA患者与健康对照组外周血CD4+T细胞亚群水平比较

2.2 调节性T细胞、Th17/调节性T细胞与RA患者实验室指标的相关性

Spearman相关性分析显示，RA患者外周血调节性T细胞水平与DAS28(r=-0.348)、ESR(r=-0.312)、抗CCP(r=-0.321)呈负相关，Th17/调节性T细胞与DAS28(r=0.336)、ESR(r=0.348)、抗CCP(r=0.325)呈正相关，但均与CRP无明显相关性(P>0.05)。见表2。

表2 调节性细胞、Th17/调节性T细胞与RA患者实验室指标的相关性

2.3 不同疾病活动度RA患者外周血CD4+T细胞亚群水平比较

三组Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞对比差异无统计学意义(P>0.05)。三组调节性T细胞、Th17/调节性T细胞比值对比差异有统计学意义(P<0.05)，进一步两两比较发现，重度活动期组调节性T细胞水平显著低于轻度活动期组(P<0.05)，而Th17/调节性T细胞比值显著高于轻度活动期组(P<0.05)，而调节性T细胞、Th17/调节性T细胞比值在轻度活动期组与中度活动期组、中度活动期组与重度活动期组之间差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 不同疾病活动度RA患者外周血CD4+T细胞亚群水平比较

3 讨论

RA所引起的滑膜炎是导致人永久伤残的疾病之一，可累及全身多关节，具有侵袭性[9]。所以对于RA活动度的临床评估和有效治疗尤为重要。RA的发病与机体免疫功能异常有关，而T细胞异常活化一直被认为是RA发病的关键因素，RA患者普遍存在T细胞亚群异常改变[10]，故临床RA治疗药物如来氟米特、甲氨蝶呤均是基于此机制，旨在抑制T细胞活化，促进T淋巴细胞亚群比例的恢复[11]。检测RA患者机体T淋巴细胞亚群比例变化，探讨其临床意义，有助于深入了解RA的发病机制，为临床诊治提供指导。

CD4+T细胞亚群参与着维持机体免疫耐受过程，对抵抗病原体有重要作用，T淋巴细胞亚群比例失衡可促进自身免疫疾病的发生发展[12]。Th1细胞是免疫调节的关键细胞，能够分泌白细胞介素-2(IL-2)、IFN-γ等多种细胞因子，调节细胞免疫应答[13]。Th2细胞能够分泌IL-6、IL-10等一系列细胞因子，辅助B细胞增殖，而参与体液免疫反应[14]。近年研究发现[15]，Th17细胞和调节性T细胞是自身免疫性疾病的重要参与者，其中Th17细胞可分泌IL-17、IL-23等多种细胞因子，而参与自身免疫疾病和慢性炎症疾病的发病[16]。调节性T细胞能够通过控制不良免疫反应过程来维持机体正常免疫耐受，能够抑制免疫防御过程中T、B细胞的异常活化，从而减轻组织损伤[17]。故研究Th17/调节性T细胞的平衡变化对于深入了解RA等免疫相关性疾病的发病机制有着重要意义。本研究对RA患者外周血CD4+T细胞亚群水平(包括Th1、Th2、Th17、调节性T细胞)进行检测发现，相比健康对照组，RA患者外周血调节性T细胞水平显著降低，Th17/调节性T细胞比值显著增高，且RA患者外周血调节性T细胞水平与DAS28、ESR、抗CCP呈负相关，Th17/调节性T细胞与DAS28、ESR、抗CCP呈正相关，这与zhang等[18]研究报道一致，提示调节性T细胞水平降低可能参与了RA的发病过程，其所致的免疫耐受下降可能是重要发病机制。

同时本研究还显示，重度活动期组调节性T细胞水平显著低于轻度活动期组，而Th17/调节性T细胞比值显著高于轻度活动期组，提示调节性T细胞水平与RA活动状态可能相关，Th17/调节性T细胞是疾病活动状态的影响因素；而调节性T细胞、Th17/调节性T细胞比值在轻度活动期组与中度活动期组、中度活动期组与重度活动期组之间差异无统计学意义，这可能与本研究样本量较小，造成统计偏差有关。有临床研究表明[19]，经过IMiDs治疗，患者调节性T细胞增加明显，并使得Th17/调节性T细胞比值下调，这有助于恢复患者机体免疫耐受状态，改善疗效。由此可见，促进调节性T细胞增殖，进而改善机体免疫耐受，有可能成为RA等风湿性疾病治疗的重要靶点。

本研究存在局限性：首先，样本量较小，统计分析难免存在偏倚，因此后续仍有待扩大样本量，继续观察CD4+T细胞亚群在RA患者中的表达变化，进一步明确CD4+T细胞亚群在RA发病中的作用，为临床诊治提供指导；其次，RA的发病机制复杂，与多种因素有关，即便是免疫系统方面也存在其他多种T细胞如CD8+CD25+T细胞、CD19+B细胞等，这在本研究中未涉及到，有待未来进一步研究观察。

综上，RA患者存在CD4+T细胞亚群失衡，主要特征表现为调节性T细胞表达下调，并且与疾病活动度存在相关性，可能参与了RA的发病过程，同时这有望为RA的治疗提供新的思路。