银翘清咽颗粒中IL-6调控成分的筛选和HPLC同时测定各组分含量

陈健勇，许俏苑

（广东省第二中医院（广东省中医药工程技术研究院），广东广州 510095）

上呼吸道感染为常见多发病症，寒热交替、环境潮湿和人群密集时犹易爆发[1]。除注意时常清洗手、口、鼻，加强锻炼，注意环境通风等良好卫生、生活习惯养成外，西医多根据病症及相关生化指标使用非甾体抗炎药、抗生素或抗病毒药进行治疗[2-3]。中医则将该病症归为湿气、寒邪入侵[4]，治疗也以行气解表，清热解毒等为主[5]。银翘清咽颗粒由我院临床验方改进、优化所得，主要药味为金银花、连翘、板蓝根、大青叶、升麻等，具有清热解毒、利咽消肿、行气解表的功效，常用于外感风寒所致的流涕、咳嗽[6-8]。研究表明，中药治疗上呼吸道感染的机制，可能与其调控机体白介素-6（ⅠL-6）水平密切相关[9-11]。ⅠL-6是机体内调控多种免疫反应的重要递质，当机体发生炎症反应或出现细菌、病毒感染等异常状况时，ⅠL-6水平出现不同程度的升高并向病变部位聚集[12-13]。因此，找到并评价银翘清咽颗粒中ⅠL-6调控活性成分，并建立同时、准确测定这些成分含量的方法，是研究该制剂功效机理和物质基础的重要途径。

1 仪器、试剂和材料

1.1 仪器Ⅴarioskan Flash全波长多功能酶标仪（美国Thermo公司）；Waters 2695高效液相色谱仪（美国Waters公司），配备PDA检测器，自动进样器和柱温箱；Mettler-Toledo精密分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 试药、材料和试剂 绿原酸（批号110753-201817，纯度96.1%）、连翘苷（批号：110821-201816，纯 度94.9%）、腺苷（批号：110879-201703，纯度99.7%）、靛玉红（批号：110717-201805，纯度99.1%）、升麻素苷（批号：111522-201913，纯度94.6%）、橙皮苷（批号：110721-201818，纯度95.3%）、柚皮苷（批号：110722-201815，纯度93.5%）购自中国食品药品检定研究院（中国）；表告依春（批号：B-014，纯度98%）购自成都瑞芬思生物科技有限公司（中国），直铁线莲宁B为实验室制备，经UⅤ测定纯度98%以上。THP-1细胞液购自ATCC公司（美国），分子生物学实验和HPLC分析用DMSO、乙腈、磷酸均为色谱纯，购自Merck（德国），供试品制备用甲醇为分析纯，购自广州化学试剂厂（中国）；ELⅠSA试剂盒购自Abcam公司；银翘清咽颗粒（批号：J1808002-1～3、J1902001-1～4、J1907005-1～3）系广东省第二中医院制剂室制备。

2 实验方法与结果

2.1 ⅠL-6调控活性成分筛选 精密吸取THP-1细胞液100μL，依次加入培养基、各组分对照品单体溶液（DMSO溶液，25mmol），一 抗（ⅠL-6抗 体，批号：ab234570）、二抗（鼠-ⅠgG，批号：ab189578），按试剂盒说明书和文献报道方法处理[12]，酶标仪测定各组荧光量，将结果与对照组（仅加入DMSO）进行比较。所得测定值结果（相对表达值）代入SPSS软件中，使用one way-ANOVA检验进行数据分析，对比各给药组与对照组的差异。结果表明，绿原酸、连翘苷、腺苷、靛玉红、表告依春、直铁线莲宁B、升麻素苷等成分具有较为明显的调控活性（P＜0.01），橙皮苷、柚皮苷与对照组比较无显著性差异（P＞0.05），结果见图1。

图1 各成分ⅠL-6调控活性

2.2 含量测定样品制备方法

2.2.1 混合对照品溶液制备方法 取绿原酸、连翘苷、腺苷、靛玉红、表告依春、直铁线莲宁B、升麻素苷对照品，分别精密称定约1mg，置于同一10mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，即得上述各化合物含量均为100μg/mL的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液制备方法 取银翘清咽颗粒，精密称取约5g，置于25mL具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25mL，密塞，精密称重，超声处理30min，取出，冷却后精密称重，加50%甲醇补足减失重量，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3 HPLC同时测定方法 取对照品和供试品溶液，使用Agilent EC C18色谱柱（柱长250mm，直径4.6mm，粒径5μm），0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B）为流动相，梯度洗脱，程序：0～15min，90%-75%A；15～25min，75%-50%A；25～40min，50%-10%A；40～55min，10%-10%A；55～60min，10%-90%A。流 速1.0mL/min，检测波长254nm，进样量10μL，柱温30℃。记录对照品和供试品色谱图，并进行峰指认，将供试品中峰面积≥对照品中峰面积10%的成分列为含量测定指标，所得色谱图见图2。

图2 银翘清咽颗粒含量测定供试品（A）和混合对照品（B，各成分浓度均为100μg/mL）色谱图

2.4 含量测定方法学考察

2.4.1 线性关系考察 取绿原酸、连翘苷、腺苷对照品，精密称取约2mg，置于同一5mL量瓶中，加50%甲醇溶解并定容至刻度，即得三种化合物浓度均为400μg/mL的溶液；精密吸取上述溶液适量，置于多个5mL量瓶中，加50%甲醇稀释并定容至刻度，即得上述各成分浓度均为5、10、20、50、100、200μg/mL的溶液。吸取上述溶液，按“2.3”所述HPLC方法测定，记录各成分峰面积，通过线性回归计算标准曲线。得腺苷的标准曲线为y=31027x+24791（r2=0.9996），连翘苷的标准曲线为y=3690.3x-1767.9（r2=0.9997），绿原酸的标准曲线为y=6705.4x-358.69（r2=0.9997）。结果表明，本方法所测定结果在5～200μg/mL浓度范围内呈线性关系。

2.4.2 精密度试验 取同一批供试品溶液（批号：J1907005-1），按“2.2.2”所述方法制备供试品溶液，吸取所得溶液，按“2.3”所述HPLC方法测定，连续进样6次，记录各成分峰面积，计算峰面积的RSD。结果显示，腺苷、绿原酸、连翘苷峰面积的RSD分别为0.83%、1.06%和1.22%，表明方法精密度良好。

2.4.3 重复性试验 取同一批银翘清咽颗粒（批号：J1907005-1），按“2.2.2”所述方法制备供试品溶液，共平行制备6份，吸取所得溶液，按“2.3”所述HPLC方法测定，记录各成分峰面积，计算上述成分的含量和含量的RSD。结果显示，腺苷、绿原酸、连翘苷含量的RSD分别为0.87%、1.31%和1.40%，表明方法重复性良好。

2.4.4 加样回收率试验 取银翘清咽颗粒，精密称取约2.5g，置于25mL锥形瓶中，精密加入绿原酸、连翘苷、腺苷混合对照品溶液适量（供试品中浓度见表1、表2、表3），分别记为低、中、高三个浓度，按“2.2.2”所述方法，自“精密加入50%甲醇25mL”起制备供试品溶液，每个浓度平行制备3份。取上述溶液，按“2.3”所述HPLC方法测定，记录各成分峰面积，计算上述成分的含量、回收率和回收率的RSD。结果显示，腺苷的平均回收率为98.61%、RSD为2.24%；绿原酸的平均回收率为100.70%、RSD为2.72%；连翘苷的平均回收率为100.24%、RSD为2.81%。上述结果表明方法准确度良好。

表2 绿原酸加样回收率试验结果（n=3）

表3 连翘苷加样回收率试验结果（n=3）

2.4.5 样品稳定性试验 取供试品溶液，放置在自动进样器中，分别于放置后0、2、4、6、8、12h按“2.3”所述HPLC方法测定，记录各成分峰面积，计算上述成分的含量和含量的RSD。结果得腺苷、连翘苷、绿原酸含量的RSD分别为1.47%、1.05%和0.93%，表明方法所制备样品在12h内稳定性良好。

2.5 IL-6调控活性成分同时测定 取各批次银翘清咽颗粒，按“2.2.2”所述方法制备供试品溶液，按“2.3”所述HPLC方法测定，记录各成分峰面积，计算上述成分的含量。结果得腺苷、连翘苷、绿原酸的 含 量 分 别 为0.1622～0.2157mg/g、0.5602～0.6904mg/g、0.4033～0.5091mg/g，见表4。

表4 含量测定结果

3 讨论

当机体产生发热、感冒、损伤等炎症反应时，体内的ⅠL类成分合成量显著增加，且向病变部位聚集，加剧炎症反应症状，升高机体产热、体温，增加能量和相关物质代谢，使相关病症加重，因此ⅠL可以作为评价病程和药物疗效的重要指标。ⅠL-6调控活性筛选结果可知，橙皮苷、柚皮苷并无明显的ⅠL-6调控活性，这可能与上述成分主要活性为抗氧化、清除自由基有关，因此并无与炎症反应和ⅠL-6代谢通路相关靶点结合并起调控作用的能力。虽然上述成分对银翘清咽颗粒的治疗功效可能有一定贡献，但由于本研究主要聚焦于ⅠL-6调控活性成分，且橙皮苷、柚皮苷药理活性研究已有较多报道[14]，故本文暂不涉及。

由于银翘清咽颗粒为多药味复方中药制剂，且ⅠL-6调控活性研究结果显示方中主要活性成分化学性质差异较大，因此各目标成分的洗脱时间差异较为明显，为这些同时测定和基线分离提供了一定的便利性[15]。但与此同时，药材提取、药物制剂工艺、供试品制备方法和分离检测用固定相、流动相等相比传统的测定一类同系物的含量测定研究，对各组分色谱行为、峰型、信号强度影响也更为显著。为建立多指标活性成分同时测定方法，本实验在色谱条件摸索过程中，主要考虑增加信号强度最低成分（在本实验中为连翘苷）的响应值，对其他成分的信号强度有一定牺牲，但并未影响目标化合物的准确测定，故采用。

由图2可知，靛玉红、表告依春、直铁线莲宁B、升麻素苷等成分的对照品溶液虽能正常出峰[16]，但在供试品中未检出或含量不符合要求（低于对照品的10%，即在银翘清咽颗粒中含量低于1/10000），因此并未被列入含量测定指标成分中。产生上述结果的原因，可能是制备颗粒用浸膏的过程中，为保持制剂与原中药汤剂的一致性而采用水提，因此出现部分成分含量较低或未检出。在今后的研究中，可考虑使用乙醇提取或高速逆流色谱法、超临界萃取法等手段，增加有效成分的种类和含量。

总而言之，本研究对银翘清咽颗粒中多种成分进行了ⅠL-6调控活性评价和含量测定研究，建立了基于功效主治的多指标含量测定方法，最终确定绿原酸、连翘苷、腺苷等三个成分同时具有明显的ⅠL-6调控活性和适宜的含量，可作为评价该制剂质量的指标成分。