中心组合设计效应面法优化枳壳中柚皮苷的提取工艺*

周 娜，谭梅英

（1.广州市司法局戒毒医院，广东广州 510435；2.广东省第二中医院（广东省中医药工程技术研究院），广东广州 510095）

枳壳性微寒，味酸、苦，具有理气宽中、行滞消胀之功效，常用于胸胁气滞、胀满疼痛、食积不化、痰饮内停、脏器下垂；该药味常见于消积化食、健胃除痞类方剂或中药制剂，也可单用水、醇提取物[1-4]。研究表明，枳壳上述功效来自其所含增进胃肠动力、抗炎、助消化和加强血流再灌注等药理活性的成分，其中以柚皮苷最为显著。该成分在芸香科植物的果实中含量较大，且水溶性较好，因此可作为枳壳水提物质量评价的指标成分[5-6]。

为优化中药提取工艺，常采用单因素考察、星点设计、正交设计等方法进行优化，中心组合设计效应面法是一种效率较高、考察较为全面的实验设计方法，研究表明该方法能够在使用最少实验次数的情况下得到最优工艺参数[7]。因此，本文拟采用该方法对枳壳水提物制备的关键参数进行优化。

1 仪器与材料

2695型高效液相色谱仪（美国Waters公司），BJH300P全自动煎药煲（天际生活电器有限公司），Mettler-Toledo电子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。柚皮苷对照品（批号：110722-201815，中国食品药品检定研究院）；枳壳饮片（广州至信药业股份有限公司）；色谱纯乙腈、乙醇（德国Merck公司）；超纯水（Watsons公司）。

2 方法与结果

2.1 中心组合设计及效应面建立 工艺参数选择提取时间、提取循环、水量三个，极值范围分别为15～90min、1～3次、10～40倍；考察指标为柚皮苷含量。上述参数输入Design Expert软件中，选择中心组合设计效应面法，由软件给出20组试验参数（含6组中心点参数，见表1），记录上述工艺参数并制备样品、测定。

表1 中心组合设计参数和结果表（n=20）

2.2 样品制备 根据“2.1”所给出各组工艺参数，根据BJH300P全自动煎药煲实际情况进行设定。取枳壳饮片20g，精密称定，按前述工艺参数制备水提液，合并煎液，纱布滤过后浓缩至≤200mL，所得浓缩液转移至250mL量瓶中，加纯水至刻度。摇匀后精密吸取所得溶液1mL，转移至10mL量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3 对照品溶液制备 取柚皮苷对照品粉末，精密称定，取约5mg，置于10mL量瓶中，加乙醇溶解并定容至刻度，即得对照品储备溶液（浓度0.5mg/mL）。

2.4 含量测定方法 含量测定使用高效液相色谱法，色谱条件为：Waters Xbridge C18色谱柱（柱长25cm，直径0.46mm，粒径5μm），流动相为乙腈-水（20:80），流速1.0mL/min，检测波长283nm，柱温30℃。所得供试品和对照品色谱图见图1。

图1 供试品和对照品（50μg/mL）色谱图

2.5 含量测定方法验证

2.5.1 线性和范围 取对照品储备溶液，加乙醇逐级稀释，制得浓度为200、100、50、10、5mg/mL的对照品溶液，吸取上述溶液，连同对照品储备溶液，由低浓度至高浓度依次注入HPLC中分析，记录每次分析所得色谱图中柚皮苷的峰面积，以峰面积为纵坐标y，浓度为横坐标x，进行线性回归，计算得回归方程为y=17247x-57540（r2=0.9993）。上述结果表明，含量测定方法在测定浓度为5～500μg/mL的柚皮苷时结果呈线性关系，满足准确测定的要求。

2.5.2 精密度 取供试品溶液（最优工艺参数批次，下同），使用“2.4”项下方法重复测定6次，记录每次分析所得色谱图中柚皮苷的峰面积，计算峰面积的RSD。结果得RSD为1.31%，表明方法精密度良好。

2.5.3 稳定性 取供试品溶液，放置于HPLC的自动进样器中，分别在放入后0、2、4、6、8、12h使用“2.4”项下方法重复测定6次，记录每次分析所得色谱图中柚皮苷的峰面积，计算含量和含量的RSD。结果显示RSD为1.08%，表明方法所制样品溶液稳定性良好。

2.5.4 重复性 使用“2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，使用“2.4”项下方法测定，记录每次分析所得色谱图中柚皮苷的峰面积，计算峰面积的RSD。结果得RSD为1.04%，表明方法重复性良好。

2.5.5 加样回收率 取浓缩定容后所得柚皮苷水提液，精密吸取0.5mL，转移至10mL量瓶中，按表2浓度加入柚皮苷对照品溶液，再加乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液，每个浓度平行制备3份。吸取上述溶液，使用“2.4”项下方法测定，记录每次分析所得色谱图中柚皮苷的峰面积，计算含量、回收率和回收率的RSD。结果得平均回收率为100.09%、RSD为2.77%，表明方法准确度良好。

表2 加样回收率测定

2.5.6 样品测定和数据分析 取“2.2”项下按照“2.1”工艺参数所制得的样品溶液，用“2.4”项下方法测定，记录每次分析所得色谱图中柚皮苷的峰面积，计算含量，所得柚皮苷含量代入Design Expert软件中进行分析。根据20批样品测定结果可知（见图2），当提取时间为45min、提取循环为2次、水量为枳壳饮片体积30倍时，水提物中柚皮苷含量为1.6768mg/mL（平均），为最优值。最高值为提取时间90min（其余与最优值同），但综合考虑能耗、效率等因素，并未被软件推荐为最优参数。上述结果软件预测值相符，表明中心组合设计效应面法能够高效、准确地筛选出枳壳水提液的最优提取工艺。

图2 中心组合设计效应面图（n=20）

3 讨论

根据中心组合设计所得样品实测结果可知，当本研究所涉及的三个参数均为最大时，所得水提物中柚皮苷的含量最高。产生上述结果的原因主要是柚皮苷较为稳定，不易受热分解或因与水长期接触而发生明显的水解反应；同时，枳壳中柚皮苷含量较大，因此增加提取时间、提取溶剂和提取次数均能够增加得率。上述结果表明，本研究选择柚皮苷作为工艺参数优化的指标成分，具有较好的科学性和适宜性，且柚皮苷所具有的药理活性，也能够较为恰当地反映枳壳的功效主治。

但与此同时，选择各考察参数时，不能单纯考虑柚皮苷的产率。这是由于当提取时间超过45min后，提取液中柚皮苷的含量增加并不明显，同样的情况也发生在提取循环从2次增加到3次时，以及提取溶剂从30倍增加至40倍时。即增加的产物与所消耗的时间、能源、溶剂等成本不成比例，反映此时效费比显著下降，继续增加相关参数并无意义。