匀浆结合超声-微波协同提取桔梗中桔梗皂苷D和党参炔苷工艺研究

张庆芬，李占君，李晓雪，孙思全，李姣，杨逢建*

(1.森林植物生态学教育部重点实验室(东北林业大学)，哈尔滨 150040; 2.黑龙江省林业科学院 伊春分院，黑龙江 伊春 153000)

0 引言

桔梗(Platycodongrandiflorus(Jacq)A.DC.)为桔梗科(Campanulaceae)桔梗属(PlatycodonA.DC.)多年生开花植物，广泛分布于我国东北、华北、华中和华南等各省区[1]。桔梗资源在我国有悠久的发展历史，其根可入药，亦可食用[2]。迄今已从桔梗根中分离出100多种化合物，主要包括皂苷类、多聚糖、黄酮类、酚类、聚炔类和甾醇类等化合物[3]。桔梗皂苷D是桔梗中的主要有效成分，《中华人民共和国药典》将其作为桔梗药材评价的质量标准，具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗癌和免疫调节等药理活性[4-6]，与此同时党参炔苷是桔梗科植物在化学分类上的特征性成分，具有抗氧化、抗胃溃疡及抗菌等药理活性[7]。因此研究桔梗根中主要活性成分的提取、含量测定对桔梗资源的开发利用具有重要意义。

近几年，从桔梗中提取分离主要活性物质方面的研究受到广大研究学者的关注[8]。常用桔梗皂苷D的主要提取方法有传统的回流法、索氏提取法(Soxhlet Extraction, SE)和超声辅助提取法(Ultrasonic assisted extraction method, UAE)等[9]。而对桔梗中党参炔苷提取工艺的相关报道较少。回流法、索氏提取法均存在提取时间长、提取后处理工作量大等缺陷，高温情况下，桔梗皂苷D和党参炔苷结构会受到破坏，因此，高效、低温的萃取方法对桔梗中主要活性的提取十分重要。匀浆法具有节约溶剂、环保和高效等特点，主要通过液力和剪切力破坏细胞组织，从而使有效成分快速溶出，目前已在传统药物的天然活性成分提取方面得到了广泛应用，常作为初级提取方法[10-11]。超声-微波协同提取法将超声波振动的空化效应和微波高能效应充分结合，能够实现快速高效地提取植物中的有效成分[12]。

本研究首次将匀浆法与超声-微波协同提取(Homogenate Pretreatment and Ultrasonic-Microwave Synergistic Extraction, HPUME)结合起来运用于桔梗中桔梗皂苷D和党参炔苷的提取，并利用单因素实验和Box-Behnken响应面实验确定该方法的最佳提取工艺，并与索氏提取、超声辅助提取工艺进行比较，证实该方法高效环保、方便快捷，为桔梗的深度开发及其他天然活性成分的提取提供理论依据。

1 材料与仪器

1.1 实验材料与试剂

实验所用的桔梗药材购买于安徽亳州药材市场。50 ℃恒温鼓风干燥，粉碎过24目备用。桔梗皂苷D标准品(HPLC级，纯度大于等于98%，上海源叶生物科技有限公司)、党参炔苷标准品(HPLC级，纯度大于等于98%，上海源叶生物科技有限公司)、超纯水实验室自制、色谱级乙腈和色谱级甲醇(SK HOLDINGS公司)、分析级乙醇(天津市致远化学试剂有限公司)。

1.2 仪器

高效液相色谱仪(型号：1260，美国安捷伦公司)；可调高速匀浆机(型号：FSH-2A，武汉格莱莫检测设备有限公司)；超声-微波协同萃取仪(型号：CW-2000，上海新拓分析仪器科技有限公司)；数控超声清洗机(型号：JP-100ST，深圳市洁盟清洗设备有限公司)；电子分析天平(型号：UH620H，日本SHIMADZU岛津)；微型中药粉碎机(型号：HC-250T，浙江河城工贸有限公司)。

2 实验方法

2.1 样品溶液的制备

精确称量5.00 g桔梗粗粉，按料液比1∶30(g/mL)加入体积分数为60%乙醇溶液，室温下匀浆(10 000 r/min)提取5 min后，立即转移到超声-微波提取仪容器中，调整温度为50 ℃，微波功率为700 W(超声额定功率为50 W)的条件下，提取10 min后，8 000 r/min离心15 min，吸取1 mL上清液用0.22 μm微孔滤膜过滤，得样品溶液。

2.2 桔梗皂苷D和党参炔苷的测定

2.2.1 测定波长的选择

对2种目标化合物的甲醇溶液进行全波长扫描，在210 nm 处测定可兼顾桔梗皂苷D和党参炔苷2个成分的最大吸收，且色谱图基线较平稳，色谱峰峰形较好，故选择210 nm作为本实验的检测波长。

2.2.2 液相色谱条件

使用Diamonsil-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)，桔梗皂苷D和党参炔苷检测条件：流动相A为乙腈，流动相B为0.1%磷酸水溶液，检测波长210 nm，柱温30 ℃；流速0.8 mL/min；进样量20 μL；梯度洗脱，洗脱梯度条件见表1。

表1 梯度洗脱程序

2.2.3 标准曲线的绘制

精密称取各对照品适量，用甲醇配制桔梗皂苷D1 mg/mL和党参炔苷0.125 mg/mL的标准品贮备溶液，将桔梗皂苷D稀释为0.032 5、0.062 5、0.125 0、0.250 0、0.500 0 mg/mL的标准品溶液，党参炔苷稀释为0.003 9、0.007 8、0.015 6、0.032 5、0.062 5 mg/mL的标准品溶液。分别进样20 μL测定峰面积值。以质量浓度(x)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标进行线性回归，分析得到

桔梗皂苷D的回归方程为y=2 927x-92.525(R2=0.999 4)，线性范围为0.032 5～0.500 0 mg/mL；党参炔苷的回归方程为y=64 778x+42.322(R2= 0.999 3)，线性范围为0.003 9～0.062 5 mg/mL。标准品和样品色谱图如图1所示。

图1 混合标准品溶液和样品溶液色谱图

2.2.4 含量的测定

由样品溶液测得峰面积值得到样品质量浓度，计算出桔梗中桔梗皂苷D和党参炔苷的含量，计算公式为

(1)

式中:Y为活性成分的含量，mg/g；C为单位体积提取液中活性成分的质量浓度，mg/mL；V为提取液总体积，mL；M为桔梗粗粉的质量，g。

2.3 单因素实验设计

2.3.1 料液比的影响

称取桔梗粗粉5.00 g，60%乙醇为提取溶剂，匀浆处理5 min，转移到超声-微波提取仪容器中，微波功率700 W，温度30 ℃，提取时间10 min，分别考察料液比为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35(g/mL)对桔梗皂苷D和党参炔苷含量的影响。

2.3.2 匀浆处理时间的影响

称取桔梗粗粉5.00 g，60%乙醇为提取溶剂，料液比1∶20(g/mL)，转移到超声-微波提取仪容器中，微波功率700 W，温度30 ℃，提取时间10 min，分别考察匀浆时间为1、2、3、4、5、6 min时对桔梗皂苷D和党参炔苷含量的影响。

2.3.3 温度的影响

称取桔梗粗粉5.00 g，60%乙醇为提取溶剂，料液比1∶20(g/mL)，匀浆处理5 min，转移到超声-微波提取仪容器中，微波功率700 W，提取时间10 min，分别考察温度为30、40、50、60、70、80 ℃对桔梗皂苷D和党参炔苷含量的影响。

2.3.4 超声微波时间的影响

称取桔梗粗粉5.00 g，60%乙醇为提取溶剂，料液比1∶20(g/mL)，匀浆处理3 min，转移到超声-微波提取仪容器中，微波功率为700 W，温度50 ℃，分别考察超声微波时间为0、5、10、15、20、25、30 min对桔梗皂苷D和党参炔苷含量的影响。

2.3.5 微波功率的影响

称取桔梗粗粉5.00 g，60%乙醇为提取溶剂，料液比1∶20(g/mL)，匀浆处理3 min，转移到超声-微波提取仪容器中，温度50 ℃，提取时间15 min，分别考察微波功率为300、400、500、600、700、800 W时对桔梗皂苷D和党参炔苷含量的影响。

2.3.6 乙醇体积分数的影响

称取桔梗粗粉5.00 g，料液比1∶20(g/mL)，匀浆处理3 min，转移到超声-微波提取仪容器中，温度50 ℃，提取时间15 min，微波功率为600 W，分别考察乙醇体积分数为30%、40%、50%、60%、70%、80%时对桔梗皂苷D和党参炔苷含量的影响。

2.4 响应面法优化提取工艺

以单因素实验结果为基础，选取对桔梗皂苷D和党参炔苷含量影响较高的3个因素：超声微波时间(A)、微波功率(B)和乙醇体积分数(C)作为自变量，采用三因素三水平设计Box-Beheken Design实验，实验因素与水平见表2。

表2 响应面实验因素水平表

2.5 提取方法的比较

2.5.1 索氏提取法

将10.00 g桔梗粉末放入滤纸包中，置于索氏提取器中，按料液比为1∶20(g/mL)加入75%的乙醇溶液，在75 ℃恒温下提取6 h，离心，取2 mL上清液过0.22 μm有机滤膜，即为索氏提取法下供试品溶液[13]。

2.5.2 超声辅助提取法

取2.00 g桔梗粉末，加入50%乙醇溶液50 mL，在超声功率为250 W的条件下超声处理30 min，冷却后称重，补足重量，离心，取2 mL上清液过0.22 μm有机滤膜，即为超声辅助提取法下供试品溶液[14]。

2.6 数据统计与处理

所有实验平行重复3次，各项数据均以算术平均值±标准差形式表示。实验数据的统计与处理使用软件Origin 2018和Design Expert 8.0.6 Trial。

3 结果与分析

3.1 单因素实验结果

3.1.1 不同料液比对目标产物含量的影响

实验得到不同料液比对目标产物含量的影响情况，如图2所示。

由图2(a)可知，当料液比为1∶10～1∶35(g/mL)时，桔梗皂苷D和党参炔苷的含量呈先升高后缓慢降低的趋势，并且在料液比等于1∶20(g/mL)时，含量最高。这是因为在一定的范围内，随着料液比的增加，使得桔梗与提取溶剂的接触率大大增加，导致桔梗皂苷D和党参炔苷的溶解量逐渐增加；而当料液比超出一定范围后，会阻碍微波与超声对溶质的辐射和空化作用，还伴随着杂质的溶出，这不但会降低目标产物的提取率，而且产生后续浓缩工业的成本[15]，故选择料液比为1∶20(g/mL)进行下一步优化。

3.1.2 不同匀浆处理时间对目标产物含量的影响

由图2(b)可知，当匀浆时间为0～3 min时，桔梗皂苷D和党参炔苷的含量呈上升趋势，当匀浆时间大于3 min时，桔梗皂苷D和党参炔苷的含量基本趋于稳定。这是因为桔梗粗粉在匀浆机的剪切作用下进一步破碎，随着匀浆时间的增长，细胞破碎度增大，提高了细胞内目标成分向溶剂乙醇溶液扩散的效率。但过长的匀浆时间，糖类和蛋白等杂质不断溶出，阻碍目标产物的溶出，使得目标产物含量不再明显增加[16]。故选择3 min作为最佳匀浆时间。

3.1.3 不同温度对目标产物含量的影响

由图2(c)可知，随着提取温度的增加，桔梗皂苷D和党参炔苷的含量也在逐渐上升，在50 ℃ 时含量最高，随后又呈下降的趋势。其原因是在一定范围内适当提升温度有利于促进溶剂在粉末与溶液体系之间的穿梭与渗透[17]，但桔梗皂苷D在高温下结构发生改变，党参炔苷结构中含有炔键，易发生加成、氧化等反应，在提取过程中，易受高温等因素的影响而发生结构变化，从而导致含量降低[18-20]。综上分析可得，选择50 ℃为最佳提取温度进行下一步优化。

3.1.4 不同超声微波时间对目标产物含量的影响

由图2(d)可知，桔梗皂苷D和党参炔苷的含量随着时间的增加而增加，提取时间达到15 min时的含量最大，15 min以后随着时间的延长提取率反而下降。这是由于随着提取时间延长，超声-微波协同提取的各种效应增强，有利于成分的溶出，但萃取体系温度升高和受热时间延长，桔梗皂苷D和党参炔苷结构可能发生变化，杂质溶出增多，导致含量下降[20-21]。因此选择10～20 min的提取时间进行后续优化实验。

3.1.5 不同微波功率对目标产物含量的影响

由图2(e)可知，桔梗皂苷D和党参炔苷的含量随着微波功率的增大而增大，当微波功率达到600 W时，含量达到最大，随着微波功率的增加桔梗皂苷D和党参炔苷的含量略有下降。这是因为超声和微波协同作用促进植物细胞壁的破裂和分子的布朗运动，进而促进了目标化合物的溶出，但微波功率过高导致萃取体系温度过高，桔梗皂苷D和党参炔苷结构受到破坏，导致含量降低[20-22]。因此选择500～700 W的微波功率进行后续优化实验。

图2 单因素实验结果

3.1.6 不同乙醇体积分数对目标产物含量的影响

由图2(f)可知，当乙醇体积分数小于60%时，桔梗皂苷D和党参炔苷含量随着乙醇体积分数的增加而增加，当乙醇体积分数高于60%时，桔梗皂苷D和党参炔苷含量随乙醇体积分数的增加而逐渐降低。这说明体积分数较高的乙醇溶液不利于目标化合物的溶出。因为桔梗皂苷D为水溶性物质，体积分数为50%～70%的乙醇与目标化合物的极性相似，有利于目标化合物的溶出。随着乙醇体积分数升高，溶剂的极性下降，对目标成分的溶解作用下降，导致含量下降。所以选择体积分数为50%～70%的乙醇进行后续优化实验。

3.2 响应面优化实验结果

3.2.1 响应模型的建立与显著性检验

响应面试验设计方案与试验结果见表3。利用Design Expert8.0.6 Trial软件对表3数据进行多元回归拟合，得到含量(Y)对超声微波时间(A)、微波功率(B)和乙醇体积分数(C)的二次多项回归方程模型如下。

表3 中心组合优化方案及结果

桔梗皂苷D：

Y1= 5.26 + 0.029A-0.090B-0.078C+ 0.063AB-0.052AC-0.014BC-0.26A2-0.29B2-0.19C2。

(2)

党参炔苷：

Y2= 0.25 + 4.875 × 10-3A-0.011B-6.625 × 10-3C+ 8.50 × 10-3AB-2.25 × 10-3AC-2.50 × 10-3BC-0.017A2-0.020B2-0.012C2。

(3)

由表4分析可知，F表示模型拟合方程的显著程度，即F越大，表示拟合程度越好。桔梗皂苷D和党参炔苷模型的F分别为55.49、19.55，P均小于0.01，表明模型拟合方程显著，模型差异极显著，具有统计学意义；失拟项分别为0.224 6、0.424 4，均大于0.05，说明差异不显著，模型拟合度良好，可对实验结果进行分析。在各影响因素中，一次项A(时间)对桔梗皂苷D含量的影响不显著，对党参炔苷含量影响显著，B(微波功率)和C(乙醇体积分数)的P均小于0.01，说明对2种目标活性成分的含量均具有极显著影响，且由F值大小可知，B>C，说明B对桔梗皂苷D和党参炔苷的含量影响最大。在组合因素中AB的P小于0.05，说明对2种目标成分的含量均有显著影响，BC、AC的P均大于0.05，说明这2个组合因素对2种目标成分含量具有不显著影响。二次项A2、B2、C2的P均小于0.01，说明对2种成分含量均具有极显著影响。

表4 响应面拟合回归方程方差分析结果

由表5可知，两模型的决定系数R2分别为0.986、0.962，调整决定系数R2分别为0.968、0.913，均大于0.9，变异系数均小于5%。结果表明，模型拟合度良好，可用于后续对实验结果的分析与预测。

表5 置信分析表

由图3(a)和图3(b)桔梗皂苷D和党参炔苷模型的残差正态分布图可以看出，目标产物的模型中的大多数点都靠近同一直线，分布合理，符合正态分布；目标产物含量的预测值与实际值的对应关系如图3(c)和图3(d)所示，大多数点都靠近同一直线，表明实际值和预测值之间有较好的一致性，可用于模型分析预测目标产物随考察条件的变化。

图3 残差的正态分布、预测值与实际值关系图

3.2.2 响应面优化伞状图

图4为关键因素响应面设计和优化所对应的伞状图，从图像中可以更直观地反映出被优化因素对响应值Y(目标产物含量)的影响强度[23]。通过分析3D伞状图可以确定优化因素的极值和中间值。由伞状图的陡峭程度和下方2D等高线的形状(圆形或椭圆形)可以看出各个因素之间的交互作用是否显著，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形与之相反[24]。结合数据和模型，响应值(Z轴)和2个影响因素(X轴和Y轴)建立RSM拟合模型，分析3D伞状图时将其中一单因素设置定量为0。

对图4(a)和 图4(b)分析可知，在一定范围内，随着A和B的提升，桔梗皂苷D和党参炔苷的含量逐渐提高，直至含量达到最高值后开始降低。由图像中可以直观地看出，图4(a)图和图4(b)图的响应曲面坡度较陡，等高线图均为椭圆形，说明A、B之间交互作用表现为差异性显著。当A为15 min，B为581 W，此时桔梗皂苷D和党参炔苷的含量最高。

同理，对图4(c)—图(f)分析可知，伞状图的曲面坡度均较平缓，等高线图均为圆形，目标产物含量最高时的条件分别为：BC(581 W, 58%)，AC(15 min, 58%)，且B、C和A、C之间交互作用均表现为差异性不显著。根据伞状图的坡度，可以得出组合影响因素AB、BC、AC中各因素的影响程度，B>A，B>C，C>A，因此B>C>A，与表4分析结果一致。

图4 优化因素的伞状图

3.2.3 验证试验

基于上述模型，优化得到的桔梗皂苷D和党参炔苷的最佳工艺条件为：匀浆预处理3 min，乙醇体积分数57.53%，料液比1∶20(g/mL)，微波功率580.55 W，提取时间15.40 min，温度50 ℃，最优预测含量分别为5.276、0.249 mg/g。为验证实验结果的可靠性，在最佳工艺条件下进行重复性实验，结果显示桔梗皂苷D和党参炔苷的含量分别为5.24 mg/g±0.13 mg/g和0.24 mg/g±0.01 mg/g，与预测值吻合度较高，说明该优化条件可靠。

3.3 与其他提取工艺比较

通过表6可知，匀浆结合超声-微波协同提取法提取桔梗皂苷D和党参炔苷的含量高于索氏提取和超声提取，具有节省提取时间、高效和不破坏活性物质结构的优点。另外超声容易在提取物周围形成超声空白区，还会造成较大的噪音[25]。

表6 不同提取工艺中主要参数及含量比较

4 结论

本文对匀浆结合超声-微波协同提取法同时提取桔梗皂苷D和党参炔苷的工艺进行了全面的研究。在单因素实验基础上，利用BBD响应面实验进行了优化分析，结果表明最佳提取工艺参数为：匀浆预处理3 min，乙醇体积分数58%，料液比1∶20(g/mL)，微波功率580 W，提取时间15 min，温度50 ℃，此条件下桔梗皂苷D的含量为5.24 mg/g±0.13 mg/g，党参炔苷的含量为0.24 mg/g±0.01 mg/g，高于传统的索氏提取法与超声辅助提取法的含量，并且具有提取时间较短、节省溶剂以及噪音小等优点。

此方法高于孙印石等[26]用微波辅助提取法得到的3.87 mg/g桔梗皂苷D得率。综上所述，匀浆结合超声-微波协同提取法在桔梗的主要活性成分的提取中更具有优势，为桔梗的深度开发利用提供科学依据。本实验只对桔梗皂苷D和党参炔苷的提取进行了研究，2种成分的分离纯化与药理活性还有待进一步研究。