nAChR激动剂对左旋多巴致老年大鼠帕金森病异动症的作用

杨虹 成静 陈芳

(武汉市第四医院 华中科技大学同济医学院附属普爱医院急诊科，湖北 武汉 430034)

帕金森病(PD)是一种主要以黑质多巴胺能神经元变性坏死引起的中枢神经系统退行性病变〔1，2〕。目前PD的一线治疗药物仍是左旋多巴(L-dopa)，它能较好地改善PD所导致的异常运动症状和提升患者的日常生活能力，但使用该药5～10年后主要不良反应异动症(LID)发病率高达80%〔3，4〕，直接导致患者的运动功能亢进和致残率的增加〔5，6〕。异动症的首选治疗药物是金刚烷胺，但它的治疗效果欠佳，而且常常因为耐药性和副作用的发生而停药〔7，8〕。

有研究显示非选择性乙酰胆碱受体(nAChR)激动剂可改善L-dopa所致PD的异动症，但其具体剂量、使用方法和机制仍不清楚。本研究给予nAChR激动剂腹腔注射老年大鼠异动症模型，监测与异动症相关的作用因子和透射电镜下观察大鼠纹状体区神经突触的超微变化，探索nAChR激动剂对L-dopa致老年大鼠PD异动症的作用。

1 材料与仪器

1.1实验动物 选择体重(220±20)g的(22±2)月龄SD老年大鼠(湖北逸挚诚生物科技有限公司)80只，性别不限。置于(25±1)℃，相对湿度为(50±10)%，在清洁级环境中白天黑夜各12 h喂养1 w，自由进食和饮水。

1.2主要试剂与实验仪器 主要试剂：6-羟基多巴胺(6-OHDA)、L-dopa、阿扑吗啡、苄丝肼、nAChR激动剂(Sigma公司)，兔抗大鼠TH(谷歌生物公司)。实验仪器：脑立体定位仪(美国Stoelting公司)，台式低温高速离心机(Sigma公司)，光学显微镜(日本Olympus公司)，脱色摇床(杭州佑宁仪器厂)。

1.3大鼠PD模型 大鼠术前禁食12 h，用10%水合氯醛以3 ml/kg速度给予大鼠腹腔注射，麻醉成功后，将大鼠头部固定于脑立体定位仪上。局部备皮消毒，依据Paxinos-Watson脑立体定位图谱〔9〕，大鼠右侧前脑内侧束(MFB)坐标定位：正中线右侧1.5 mm，前囟后4.4 mm，硬膜下7.8 mm。抽取6 μl 6-OHDA溶液，进针至硬脑膜下-7.8 mm处，按0.5 μl/min速度向MFB注射。在手术操作14 d后皮下注射阿扑吗啡(0.1 mg/kg)，诱导大鼠向对侧旋转，10 min后计算30 min大鼠的旋转圈数。大鼠PD模型标准：平均旋转圈数>7圈/min。

1.4大鼠PD异动症模型 建立L-dopa致大鼠PD异动症模型：造模成功的PD大鼠每日腹腔注射L-dopa(10 mg/kg)和苄丝肼(2.5 mg/kg)1次，持续14 d。然后每天注射L-dopa 10 min前，给予生理盐水(1 ml/kg)或nAChR激动剂(0.1 mg/kg)腹腔注射，持续21 d。

1.5异常不自主运动(AIM)评分 AIM分为〔10〕：(1)前肢AIM(2)轴性AIM(3)口面部AIM(4)对侧旋转运动AIM。成功建立大鼠PD异动症模型后，持续给予生理盐水或nAChR激动剂治疗21 d。在第1天和第21天进行6次AIM评分，给药20 min后，持续观察1 min进行评分，间隔20 min 1次。AIM评分为4种评分之和。AIM最高评分72分(评分6次，单次最高评分为12分)。

1.6实验分组 随机将造模成功的PD大鼠分为3组：(1)control组(n=20)：手术毁损大鼠MFB，予以等量生理盐水35 d；(2)L-dopa对照组(n=20)：建立PD模型后给予L-dopa和苄丝肼连续14 d，然后在给予L-dopa和苄丝肼治疗前10 min给予生理盐水，连续21 d；(3)nAChR激动剂组(n=20)：建立PD模型后给予L-dopa和苄丝肼连续14 d，然后在L-dopa和苄丝肼治疗前10 min给予nAChR激动剂连续注射21 d。

1.7观察纹状体神经突触 异动症模型大鼠在第21天予以L-dopa注射1 h后，10%水合氯醛(5 ml/kg)腹腔注射麻醉，用4%多聚甲醛行心脏灌流固定。取出大鼠脑组织后在毁损侧纹状体区切取1 mm×1 mm×1 mm组织块放入2.5%戊二醛中浸泡。标本予以固定、包埋、铅和铀双染色后制成铜网，在透射电镜下观察纹状体区神经突触后致密带的宽度和突触间隙。

1.8统计学分析 采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1异动症大鼠模型制作结果 PD大鼠经L-dopa治疗后，62只(71.0%)出现 AIM，平均出现时间(1.8±1.2)d，16只(20.0%)未出现AIM或AIM评分达不到异动症模型标准，2只(3.2%)死亡。异动症的主要表现为毁损对侧旋转行为和刻板动作， 如对侧前肢不自主上下拍打、抓挠或颤抖；嘴巴出现不自主舔舐、咀嚼；颈部和躯干向健侧扭转；快速地向对侧旋转、首尾相连；偶向健侧伸舌等。治疗全程中，4～7 d达到典型异动症标准， 14～21 d达到高峰。

2.21 d nAChR激动剂治疗不能改善PD大鼠异动症 PD大鼠注射L-dopa 14 d后随机分配到L-dopa对照组和nAChR激动剂组，L-dopa对照组AIM评分〔(32.01±3.22)分〕与nAChR激动剂组〔(29.11±2.88)分〕无统计学差异(P>0.05)。nAChR激动剂干预1 d时，L-dopa对照组AIM评分〔(29.51±3.10)分〕与nAChR激动剂组〔(28.82±2.07)分〕无统计学差异(P>0.05)。表明1 d nAChR激动剂对PD大鼠异动症无明显改善作用。

2.321 d nAChR激动剂可减轻PD大鼠异动症 持续予以nAChR激动剂21 d后对PD大鼠进行AIM评分。nAChR激动剂组AIM评分〔(21.15±2.08)分〕较L-dopa对照组〔(32.01±3.22)分〕显著降低(P<0.05)。分别比较AIM的4个部分，L-dopa对照组轴性及前肢AIM评分均显著高于nAChR激动剂组(P<0.05)，而两组口面部及对侧旋转运动AIM评分无统计学差异(P>0.05)。见表1。

2.4纹状体区神经突触的超微结构 L-dopa对照组与control组比较，突触后膜致密带宽度显著增大,突触间隙宽度显著变窄(P<0.05)。nAChR激动剂组与L-dopa对照组相比，突触后致密带宽度显著减小,突触间隙的宽度显著变大(P<0.05)，见表1。

表1 各组轴性AIM、前肢AIM、口面部AIM、对侧旋转运动AIM评分、纹状体突触宽度及致密带宽度

3 讨 论

L-dopa治疗PD 5年后有40%～90%患者出现异动症，严重降低PD患者生活质量甚至致残。治疗异动症的药物包括作用于多种神经递质多巴胺能、谷氨酸能、5-羟色胺能、γ-氨基丁酸(GABA)能、腺苷受体、肾上腺神经的药物，还有nAChR激动剂、马福利特、咖啡因等〔11～14〕。本研究PD大鼠异动症随治疗时间延长程度逐渐加重，这可能和波动性L-dopa治疗和黑质纹状体多巴胺能神经元变性坏死增多有关。实验证明无论是间歇性nAChR激动剂治疗还是持续nAChR激动剂治疗,都可能有助于治疗PD患者L-dopa所致的运动障碍〔15〕。nAChR亚型中有α4β2，α6β2 和α7 nAChR在纹状体中表达。Johnston等〔16〕发现长期服用nAChR激动剂的L-dopa大鼠,无论是间歇注射还是通过渗透泵给药,nAChR激动剂对改善已建立的口舌部和前肢的表达有类似作用。Iderberg等〔11,12,17〕发现nAChR激动剂可减轻PD猴子模型和啮齿类动物模型的异动症症状，表明nAChR激动剂在多种物种中均有效。有以下可能的作用机制：①通过 nAChR作用影响多巴胺能神经元的活性，促进多巴胺释放，减轻黑质纹状体区神经元的损害 。②nAChR激动剂可激活黑质多巴胺神经元α7 nAChRs，刺激抗炎的信号通路参与调节细胞因子产生，如肿瘤坏死因子(TNF)-α、干扰素(IFN)-γ 和白细胞介素(IL)-6〔18〕，从而减轻神经系统炎症；通过nAChR降低多巴胺能神经元中不稳定铁元素的含量发挥神经保护作用〔19〕。异动症是L-dopa治疗PD后神经细胞产生被动适应和可塑变化的结果 。本研究结果示持续21 d nAChR激动剂治疗可明显减轻神经突触超微结构的变化。可能缘于该药治疗干扰正常多巴胺运动神经元生理调控机制。神经元的可塑性表现在功能上的改变如神经递质释放的增加 ，受体敏感性的增强；表现在解剖上的改变比如轴突的再生长，出现萌芽和新生突触〔20〕。