减味二藤汤对宫腔机械性损伤大鼠子宫内膜基质细胞过氧化物酶体增殖物激活受体α/脂肪酸氧化信号通路的影响

胡昀昀，应翩，杨华娣，张瑜芯，姚志韬

（1.浙江省中医药大学附属第一医院，浙江杭州 310006；2.浙江中医药大学，浙江杭州 310006）

宫腔机械性损伤所致的宫腔粘连（intrauterine adhesion，IUA）是由于子宫内膜基底层损伤后继发肌壁间粘连，导致宫颈管、子宫部分或全部闭塞，引起月经异常、腹痛、不孕等症状的疾病[1]。据报道，25%～30%[1]女性在多次人工流产、刮宫后均可出现宫腔粘连，其中仅22.5%～33.3%[2]可出现再次妊娠，严重影响女性的生殖健康。减味二藤汤是本课题组在国家级名老中医裘笑梅经验方二藤汤的基础上化裁而成，对肾虚为本、瘀热互结引起的盆腔感染、月经异常有确切疗效[3]。前期临床研究发现，减味二藤汤能减轻中重度宫腔粘连分离术后患者的月经情况及妊娠结局[4-5]，但该方的具体作用机制尚不明确。子宫内膜纤维化是宫腔粘连的主要病理学特征，是其本质[6-7]。近年来研究发现，胞内脂质累积出现脂毒性，可导致各类重要器官纤维化，如肝纤维化、肾纤维化等[8-9]，其中，过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPAR-α）调控的脂肪酸氧化（FAO）是细胞纤维化的关键途径[10-11]。那么，减味二藤汤是否可以通过激活PPAR-α/FAO信号通路、诱导脂肪酸氧化来达到抑制宫腔机械性损伤大鼠的子宫内膜纤维化进程？基于此，本课题组拟通过观察减味二藤汤对宫腔机械性损伤大鼠子宫内膜基质细胞（ESCs）中PPAR-α/FAO相关蛋白的影响，探讨其可能的干预机制，以期为中医证治宫腔机械性损伤导致的宫腔粘连纤维化提供新的依据，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物健康SPF级8周龄雌性SD大鼠，8周龄雄性Wistar大鼠，体质量（220±20）g，各10只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2016-0011。饲养于浙江中医药大学动物实验中心，饲养室温控制在22～24℃，相对湿度40%～70%，自由饮食、饮水，昼夜明暗交替时间为12 h/12 h。

1.2 试剂与仪器PPAR-α抑制剂GW6471（美国Sigma公司）；DMEM/F12培养液及胎牛血清（FBS）（美国Gibco公司）；细胞计数试剂盒8（CCK-8，碧云天生物技术有限公司）；十二烷基硫酸钠（SDS）、甲醇（国药集团化学试剂有限公司）；α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体、I型胶原蛋白（Collagen I）抗体、纤连蛋白（Fibronectin）抗体、PPAR-α抗体、酰基辅酶A氧化酶1（ACOX1）抗体、肉毒碱棕榈酰基转移酶1A（CPT1A）抗体（美国Abcam公司）；GAPDH抗体（杭州贤至生物有限公司）；辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗小鼠亲和免疫球蛋白（IgG）（H+L）二抗、HRP标记山羊亲和抗兔IgG（H+L）二抗（武汉博士德生物工程有限公司）。IX51倒置荧光显微镜（美国Leica公司）；SW-CJ-1FD无菌操作台（苏州净化设备有限公司）；台式低速离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；电泳仪、垂直电泳槽（北京六一仪器厂）。

1.3 药物及制备减味二藤汤由红藤20 g、忍冬藤20 g、威灵仙15 g、菟丝子10 g、牡丹皮5 g组成，以上中药饮片购自浙江省中医院中药房。取药材按8倍比例加水，浸泡20 min，文火煎煮40 min，用纱布滤净再加8倍水，文火煎煮30 min，纱布过滤，合并滤液，浓缩定容至100 mL，其原液质量浓度为0.7 g/mL。放入玻璃瓶中，密封，标记，冷藏。

1.4 实验动物模型建立及分组采用机械性损伤法建立宫腔粘连大鼠模型[12]。将10只性成熟未交配的雌性SD大鼠，适应性喂养1周。于每日8∶00、16∶00行阴道涂片，显微镜下观察阴道上皮细胞的形态，确定大鼠动情周期。取动情期SD大鼠建模，随机选择5只大鼠（右侧子宫）作为模型组，另5只大鼠作为正常组。方法：术前禁食12 h，腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉大鼠后，将大鼠仰卧位固定在手术板上，碘伏消毒，于下腹部正中做一长为2～3 cm的纵行切口，进入腹腔，暴露“V”形子宫。于右侧子宫中上1/3处剪开一直径2 mm纵切口，使用直径2 mm刮匙上下刮取子宫内膜组织。刮宫时可用指腹捏住子宫，感知刮宫程度，防止刮穿子宫肌层，子宫壁菲薄半透明时停止刮宫，采用可吸收线缝合切口，逐层关腹。术后肌肉注射青霉素钠200 U·g-1，连续3 d，预防感染。术后每日观察大鼠的精神状态、饮食、排便及体质量情况。于造模后14 d取样分离细胞。

1.5 细胞的分离、体外培养正常大鼠ESCs来源于正常组8周龄正常动情期雌性SD大鼠的子宫内膜组织，纤维化ESCs来源于模型组刮宫之后的雌性SD大鼠子宫内膜组织。收集的子宫内膜组织，采用预冷的HBSS清洗3次后，剔除血块及黏液，将子宫内膜组织剪成0.5～1 mm3大小的碎块，离心去除上清液，向组织沉淀中加入0.8 mg·mL-1的Ⅰ型胶原酶，37℃、5%CO2培养箱中消化约60 min，每15 min震荡1次。采用DMEM/F12培养液+10%FBS培养液终止消化，移液器吹散组织块，吸取细胞悬液，经400目筛网过滤，去除未完全消化的组织块及其他杂质成分。细胞滤液采用DMEM/F12培养液+10%FBS培养液进行原代细胞培养。每2～3 d进行换液，待细胞生长至90%，即可传代。根据细胞生长状态取第3代细胞进行后续实验。

分离的第3代ESCs，光镜下观察呈纺锤形，然后采用免疫荧光染色法检测Vimentin的阳性表达情况，确定细胞纯度。

1.6含药血清制备健康8周龄Wistar雄性大鼠10只，分为空白血清组3只，含药血清组7只。根据人与大鼠等效剂量换算法[13]计算，含药血清组按6 g/kg减味二藤汤水煎液灌胃，空白血清组给予灌胃等体积生理盐水，早晚10∶00各1次，连续给药7 d。第7天给药后禁食不禁饮，最后一次给药2 h后腹腔麻醉、取血、离心、滤膜除菌后保存于-80℃冰箱备用。

1.7 分组与给药将细胞按照来源与给药不同分为5组，即正常组、模型组、减味二藤汤含药血清组（简称含药血清组）和空白血清组、拮抗剂组。正常组，即正常组大鼠ESCs+10%FBS；模型组，即模型大鼠ESCs+10%FBS；含药血清组，即模型大鼠ESCs+10%含药血清；空白血清组，即模型大鼠ESCs+10%不含药血清；拮抗剂组，即模型大鼠ESCs+10%含药血清+10μmol·L-1PPAR-α拮抗剂GW6471。各组给药48 h。

1.8 CCK-8法 观 察ESCs活 性将ESCs按 照1×104/mL接种于96孔板中，各组细胞处理完成后，每孔加入10μL CCK-8溶液，置于37℃孵育4 h后，用酶标仪测定。另设不加细胞仅含有培养液的空白孔调零。每组均设定3个复孔，实验重复3次。

1.9 Western Blot法检测ESCs中PPAR-α、ACOX1、CPT1A、α-SMA、CollagenⅠ、Fibronectin蛋 白表达各组细胞处理完成后，裂解提取总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，将蛋白水浴煮沸5 min使其变性，自然冷却后-20℃保存。实验时，每个SDS-PAGE泳道分别加入50μg蛋白质，电泳时间约为2 h后将蛋白电转至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，5%脱脂奶粉的TBST浸泡PVDF膜，室温低速摇床封闭2 h。0.1%TBST清洗封闭后的条带膜，根据各目的蛋白质分子量切膜，各指标分别用相应的一抗（GAPDH以1∶1 000稀释，PPAR-α、ACOX1、CPT1A、α-SMA、CollagenⅠ及Fibronectin以1∶1 500稀释）孵育，4℃过夜。次日，TBST充分洗涤PVDF膜，分别加入相应的HRP标记的二抗（HRP标记山羊抗小鼠IgG，1∶5 000稀释；HRP标记山羊抗兔IgG，1∶5 000稀释），37℃摇床孵育2 h，TBST充分洗涤。利用电化学发光（ECL）试剂显色，最后，使用ImageJ软件（National Institutes of Health，美国）进行分析，目的蛋白的相对表达以目的蛋白与内参蛋白（GAPDH）灰度值比值表示。实验重复3次。

1.10 统计方法采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，计量资料呈正态分布且方差齐性，以均值±标准差（±s）表示，多组间比较用单因素方差分析。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠ESCs的鉴定图1结果显示，宫腔机械性损伤大鼠体外培养的ESCs和正常大鼠体外培养的ESCs波形蛋白（Vimentin）表达阳性，而模型大鼠ESCs表达量较正常大鼠ESCs增多，提示模型大鼠存在ESCs纤维化。

图1 细胞免疫荧光法检测ESCs中波形蛋白（Vimentin）表达结果（×200）Figure 1 Results of Vimentin expression in ESCs detected by cellular immunofluorescence（×200）

2.2 各组ESCs活力比较图2结果显示：与正常组比较，模型组的ESCs活性显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，空白血清组的ESCs活性无明显差异（P＞0.05）；与空白血清组比较，含药血清组ESCs活性降低（P＜0.01）；与含药血清组比较，拮抗剂组ESCs活性升高（P＜0.05）。表明减味二藤汤对ESCs活性具有明显的抑制作用，而PPAR-α拮抗剂GW6471处理可明显拮抗减味二藤汤的抑制作用，使ESCs活性增强，这提示减味二藤汤可通过激活PPAR-α抑制ESCs活性。

图2 各组子宫内膜基质细胞（ESCs）活力比较Figure 2 Comparison of the viability of ESCs among various groups

2.3 各组大鼠ESCs中PPAR-α、ACOX1、CPT1A、α-SMA、CollagenⅠ、Fibronectin蛋白表达比较

图3、表1结果显示：与正常组比较，模型组ESCs中α-SMA、CollagenⅠ、Fibronectin蛋白表达水平升高（P＜0.05），PPAR-α、ACOX1、CPT1A蛋白表达水平降低（P＜0.05）；模型组各指标与空白血清组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；与空白血清组比较，含药血清组ESCs中α-SMA、CollagenⅠ、Fibronectin蛋白表达水平降低（P＜0.05），PPAR-α、ACOX1、CPT1A蛋白表达水平升高（P＜0.05）；与含药血清组比较，拮抗剂组ESCs中α-SMA、CollagenⅠ、Fibronectin蛋白表达水平升高（P＜0.05），PPAR-α、ACOX1、CPT1A蛋白表达水平降低（P＜0.05）。表明PPAR-α拮抗剂GW6471能有效阻断减味二藤汤对ESCs的抑制作用，进一步表明减味二藤汤可以有效降低子宫内膜机械性损伤大鼠ESCs的纤维化蛋白表达，其作用途径可能是通过激活PPAR-α完成的。

图3 各组子宫内膜基质细胞（ESCs）过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPAR-α）、酰基辅酶A氧化酶1（ACOX1）、肉毒碱棕榈酰基转移酶1A（CPT1A）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、I型胶原蛋白（CollagenⅠ）、纤连蛋白（Fibronectin）蛋白电泳图Figure 3 Protein electrophoresis of peroxisome proliferator-activated receptor alpha（PPAR-α），acyl coenzyme A oxidase 1（ACOX1），carnitine palmitoyltransferase 1A（CPT1A），α-smooth muscle actin（α-SMA），CollagenⅠ，Fibronectin in each group

表1 各组大鼠子宫内膜基质细胞（ESCs）过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPAR-α）、酰基辅酶A氧化酶1（ACOX1）、肉毒碱棕榈酰基转移酶1A（CPT1A）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、I型胶原蛋白（CollagenⅠ）、纤连蛋白（Fibronectin）相对蛋白表达量比较Table 1 Comparison of relative protein expression levels of peroxisome proliferator-activated receptor alpha（PPAR-α），acyl coenzyme A oxidase 1（ACOX1），carnitine palmitoyltransferase 1A（CPT1A），α-smooth muscle actin（α-SMA），collagen type I（CollagenⅠ）and fibronectin（Fibronectin）among various groups of ESCs in rats （±s）

表1 各组大鼠子宫内膜基质细胞（ESCs）过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPAR-α）、酰基辅酶A氧化酶1（ACOX1）、肉毒碱棕榈酰基转移酶1A（CPT1A）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、I型胶原蛋白（CollagenⅠ）、纤连蛋白（Fibronectin）相对蛋白表达量比较Table 1 Comparison of relative protein expression levels of peroxisome proliferator-activated receptor alpha（PPAR-α），acyl coenzyme A oxidase 1（ACOX1），carnitine palmitoyltransferase 1A（CPT1A），α-smooth muscle actin（α-SMA），collagen type I（CollagenⅠ）and fibronectin（Fibronectin）among various groups of ESCs in rats （±s）

①P＜0.05，与正常组比较；②P＜0.05，与模型组比较；③P＜0.05，与空白血清组比较；④P＜0.05，与含药血清组比较

组别正常组模型组空白血清组含药血清组拮抗剂组α-SMA/GAPDH 0.196±0.009 0.812±0.083①0.772±0.060①0.481±0.033①②③0.686±0.040①③④CollagenⅠ/GAPDH 0.331±0.028 0.794±0.046①0.768±0.044①0.501±0.021①②③0.642±0.033①②③④Fibronectin/GAPDH 0.380±0.054 0.899±0.066①0.863±0.097①0.573±0.067①②③0.905±0.062①③④PPAR-α/GAPDH 0.922±0.053 0.490±0.037①0.485±0.023①0.720±0.048①②③0.535±0.029①③④ACOX1/GAPDH 0.896±0.065 0.398±0.055①0.324±0.018①0.854±0.029②③0.383±0.026①③④CPT1A/GAPDH 0.845±0.077 0.229±0.014①0.211±0.006①0.642±0.017①②③0.388±0.033①②③④

3 讨论

目前宫腔机械性损伤引起的宫腔粘连发病机制尚不完全清楚，其本质为子宫内膜纤维化。研究发现，组织纤维化与胞内脂质的累积出现脂质毒性相关[5，14-16]。那么，如何有效促进ESCs的脂肪酸氧化，改善局部纤维化是目前值得深入研究的问题。

近年来研究发现，PPAR-α/FAO通路对维持脂质代谢的平衡起着十分重要的调节作用。激活PPAR-α可促进FAO进程，使细胞外基质进入细胞，由溶酶体进行降解，并减少脂肪酸（free fatty acid，FFA）和甘油三酯（triglyceride，TG）的合成，从而减轻细胞内脂质蓄积[17]。FAO限速步骤之一是FA进入线粒体，此过程由酰基辅酶A氧化酶（Acyl-Co A Oxidase，ACOX）依赖性的转运系统控制，其中涉及的肉碱棕榈酰基转移酶I（carnitine palmitoyl transferase 1，CPT1）是PPAR-α的直接靶基因[18]。

中医学并无宫腔粘连的病名，可将其归属于“月经过少”“不孕”“痛经”等范畴，且认为其主要是由宫腔金刃损伤胞脉、脉络瘀阻，致肾中精气受损，冲任气血不足，胞脉闭塞所致。叶天士云：“大凡络虚，通补最宜。”故以活血通络为主导，少佐补肾通经之品，通补兼施，可达治疗IUA的目的[19]。减味二藤汤是由国家级名老中医裘笑梅经验方二藤汤筛选化裁而来，方中：君药红藤、忍冬藤可清热通络，臣药威灵仙散结通络，佐药菟丝子可平调肾中阴阳，使药牡丹皮凉血活络，诸药合用可清热凉血、通经活络，共奏调控肾-天癸-冲任-胞宫轴之效，从而达到补肾通络调经的目的。本研究结果显示，与正常组比较，模型组ESCs中α-SMA、CollagenⅠ、Fibronectin蛋白表达水平升高，PPAR-α、ACOX1、CPT1A蛋白表达水平下降，提示宫腔机械性损伤大鼠ESCs中PPAR-α/FAO通路受抑制，而与模型组/空白血清组比较，减味二藤汤含药血清组ESCs中α-SMA、CollagenⅠ、Fibronectin蛋白 水平 降低，PPAR-α、ACOX1、CPT1升高，表明减味二藤汤可通过激活PPAR-α/FAO通路发挥改善ESCs纤维化的作用。

本研究发现，给予PPAR-α拮抗剂GW6471进行干预，与减味二藤汤含药血清组比较，拮抗剂组ESCs中PPAR-α、ACOX1、CPT1A蛋白表达水平降低，α-SMA、CollagenⅠ、Fibronectin表达升高，细胞活性上升，表明GW6471可阻断减味二藤汤对机械性损伤宫腔粘连大鼠ESCs纤维化的抑制作用，进一步表明减味二藤汤可通过激活PPAR-α/FAO通路实现对ESCs纤维化的改善作用。

综上所述，减味二藤汤可激活PPAR-α/FAO通路，抑制ESCs纤维化进程，从而改善宫腔机械性损伤引起的宫腔粘连纤维化。