基于“肠道菌群-肠-脑轴”探讨半夏泻心汤改善大鼠糖尿病认知功能障碍作用机制

徐欢，刘燕凤，杨超茅，杨志新

（上海市宝山区中西医结合医院，上海 201900）

糖尿病认知功能障碍（diabetic cognitive dysfunction）是2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）常见的中枢神经系统并发症[1]，以学习记忆能力下降为主要表现，严重者可发展为痴呆，严重影响患者生活质量。数据统计显示，我国糖尿病患者人数居世界首位[2]。寻找有效治疗糖尿病认知功能障碍的药物成为临床研究的热点。一般而言，糖尿病患者均存在不同程度的胃肠功能紊乱[3]，由于胃肠运动功能紊乱所致吸收的异常，及胃排空和肠道对食物的推动、吸收与血浆胰岛素水平相互作用，常影响口服降糖药物及其他药物的疗效，进而影响糖尿病的良好控制。中医亦认为，脾胃虚弱、饮食壅滞是诱发糖尿病的重要因素。故从胃肠功能紊乱角度对其进行有效治疗具有重要的意义。《伤寒论》经典方剂半夏泻心汤具有寒热平调、消痞散结、辛开苦降、补泻同施、化痰行瘀的功效[4]，广泛应用于功能性消化不良、胆汁反流性胃炎、胃食管反流病、消化性溃疡、慢性萎缩性胃炎、胃癌及术后等消化道系统疾病的治疗[5]。有学者研究[6-9]发现，半夏泻心汤能改善大鼠胃肠动力障碍，调节肠道菌群，恢复肠道微生态稳态，可以有效调节血糖，改善胰岛功能。而“肠道菌群-肠-脑轴”在神经、精神发育和胃肠道疾病的生物和生理学基础研究领域中越来越受关注[10]。因此，本研究以此为切入点，通过构建糖尿病认知功能障碍大鼠模型，观察半夏泻心汤的干预作用及机制，以期为临床应用半夏泻心汤治疗糖尿病认知功能障碍提供依据。现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF级雄性SD大鼠60只，4～6月龄，体质量180～220 g，购自长沙市天勤生物有限公司，生产许可证号：SCXK（湘）2014-0010。大鼠统一饲养在SPF级动物室，保持室温21～23℃，光照12 h/黑暗12 h循环昼夜交替。所有大鼠所用的饲料、水、垫料均经过严格灭菌处理，自由饮水摄食。动物实验在本院进行。

1.2 试剂与仪器Aβ25-35、链脲佐菌素（STZ，美国Sigma公司）；微管相关蛋白轻链3（LC3）抗体、Beclin-1抗体（美国Abcam公司）；TRIzol试剂（美国Ambion公司）；cDNA逆转录试剂盒（美国Thermo Scientific公司）。RM2016病理切片机（上海莱卡仪器有限公司）；电泳仪（美国Bio-Rad公司）；光学显微镜（日本尼康公司）。

1.3 药物及制备半夏泻心汤，由半夏12 g、黄芩9 g、干姜9 g、人参9 g、炙甘草9 g、黄连3 g、大枣4枚组成，购于上海市宝山区中西医结合医院药剂科。将中药材浸泡在1 L蒸馏水中2 h，常规煎煮2次后，合并煎液，纱布过滤，加热蒸发，直至煎液终浓度为1.7 g（生药）/mL，置于无菌瓶中4℃环境保存。

1.4 分组、模型制备与给药将60只大鼠随机分为2组，空白组10只和实验组50只。实验组50只大鼠构建糖尿病认知功能障碍模型。方法[11]：给予大鼠高脂饲料（按质量分数配比：70%常规饲料、10%猪油、5%蛋白粉、0.5%胆固醇、10%蔗糖）喂养4周，第4周末的前1 d 17∶00开始禁食不禁水，第2天9∶00一次性腹腔注射STZ溶液35 mg/kg，72 h后检测空腹血糖。空腹血糖值≥11.1 mmol/L者进入下一步实验。将大鼠麻醉后固定在脑立体定位仪上，用微量注射泵将10μL Aβ25-35缓慢注入双侧海马（以前卤为原点，向后4.4 mm、旁开2.2 mm为穿刺点，自脑表面进针3.0 mm），若Morris水迷宫试验逃避潜伏期延长、穿越目标区次数减少则判断模型制备成功。空白组给予基础饲料喂养，不予任何处理。

将造模成功的实验组大鼠随机分为5组，模型组，半夏泻心汤低、中、高剂量组和二甲双胍组，每组10只。各组注射Aβ25-35前1周开始灌胃相应药物。半夏泻心汤低、中、高剂量组分别对应灌胃半夏泻心汤煎液0.425、0.85、1.70 g·kg-1·d-1[12]，二甲双胍组灌胃二甲双胍0.30 g·kg-1·d-1[12]，模型组及空白组大鼠均灌胃等体积的生理盐水。每日1次，连续28 d。

1.5 观察指标与方法

1.5.1 空腹血糖变化 分别于造模前、造模后及给药后，禁食12 h，大鼠尾静脉采血，血糖仪测定空腹血糖。

1.5.2 Morris水迷宫试验 给药第23天开始进行训练。前4 d给予常规训练，每日1次。定位航行能力检测：于直径250 cm、高度50 cm，水深25 cm、水温20℃的圆形水池内进行测试。将水池划分为4个象限，于中央设置一个圆台，分别从迷宫的4个象限将大鼠背对隐藏在水面下的平台放入水中，记录大鼠90 s寻找到水下平台所需的时间，即为大鼠逃避潜伏期。若大鼠找不到平台，将大鼠重新引至平台，记录逃避潜伏期为90 s。第5天测试大鼠从第3象限找到平台的时间为最终数据。空间探索能力检测：定位航行能力检测后将中央平台取出，记录大鼠90 s内于目标象限内的滞留时间。

1.5.3 流式细胞术检测血清T淋巴细胞亚群 给药结束后麻醉大鼠，腹主动脉取血3 mL，室温静置2 h，4℃环境以3 000 r/min（离心半径4.5 cm）离心5 min，分离血清，流式细胞仪检测血清中CD8+T淋巴细胞比例、CD4+T淋巴细胞比例及CD4+/CD8+比值。

1.5.4 蛋白质免疫印迹（Western Blot）法检测脑组织自噬相关蛋白LC3、Beclin-1表达 取大鼠脑组织，加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂裂解脑组织，离心收集上清液，采用二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量测试盒检测总蛋白浓度。每孔上样8μg总蛋白样品，经5%～17%十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯胺凝胶电泳（PAGE）后，转聚偏氟乙烯（PVDF）膜，继用5%脱脂奶粉封闭2 h，用LC3、Beclin-1、β-actin一抗稀释液（均为1∶1 000）室温孵育2 h，辣根过氧化物酶标记的IgG二抗稀释液（1∶5 000）室温孵育1 h。按照电化学发光（ECL）试剂盒说明书操作，将发光液均匀滴在PVDF膜上，反应1 min，最后将膜放入暗室压片成像。用Quantity One软件对显影条带进行分析，结果用目的蛋白灰度值与内参灰度值的比值表示。

1.5.5 肠道菌群16S-rDNA测序 提尾反射法留取大鼠粪便。样本进行基因组DNA抽提，所得DNA经Qu-bit 2.0荧光计和0.8%琼脂糖凝胶电泳质检。质控标准：电泳时必须有1条大于10 kb的主带，并且主带下无明显弥散带/无降解。将质检合格的DNA按照MiSeq测序系统使用说明书准备测序试剂。将所提取到的DNA于-80℃保存。前引物序列：5’-CCTACGGGRSGCAGCAG-3’；后引物序列：5’-GGACTACVVGGGTATCTAATC-3’。将得到的PCR产物构建测定文库，采用Illumina MiSeq平台测序，对高通量测序数据进行生物信息学分析，该部分由上海锐翌生物科技有限公司完成。根据各样本生成的操作分类单元（OTU）数，对样本序列随机抽样，以抽取的序列数及该序列所代表的OTU数构建曲线，计算样本的α多样性，属于α多样性分析。其中，Chao 1指数和Shannon指数是反映物种丰富度的指标。并采用Beta多样性分析中Metastats分析方法，检测客观宏基因组样本的差异丰度特征，找出2个样本组中具有显著差异的微生物类型。

1.5.6 实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）法检测脑组织中蛋白激酶A（PKA）、环腺苷酸（cAMP）反应元件结合蛋白（CREB）mRNA表达 取大鼠100 mg脑组织加入1 mL TRIzol，用小剪刀将其剪碎，利用匀浆器将脑组织充分均浆，依照RNA提取试剂盒步骤提取脑组织总RNA，通过微量紫外分析仪检测总RNA浓度与纯度，琼脂糖凝胶电泳分析RNA的完整性。取16μL总RNA联合逆转录试剂盒试剂形成40μL体系逆转录为cDNA。以完整逆转cDNA为模板，按照SYBR Green Realtime PCR Maeter Mix说明书加入相关试剂及引物最终成为20μL体系进行PCR扩增。PKA上游引物序列为5’-TTTGCCAAGCGTGTGAAAGGG-3’，下游引物序列为5’-GGATAATCTCGGGGGCCAAG-3’，扩增片段长度339 bp；CREB上游引物序列为5’-GT ATCCATGCCAGCAGCTCA-3’，下游引物序列为5’-CATGGACCTGGACTGTCTGC-3’，扩增片段长度392 bp；GAPDH上游引物序列为5’-ACAGCAAC AGGGTGGTGGAC-3’，GAPDH下游引物序列为5’-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3’，扩增片段长度413 bp。具体反应条件：预变性95℃2 min；变性95℃15 s，退火61℃30 s，延伸72℃15 s，40个循环。以GAPDH为内参，采用2-△△Ct法分析目的基因的相对表达量。

1.6 统计方法采用Graphpad Priam 8.0软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示。多组间数据比较采用单因素方差分析（Oneway ANOVA），两组间比较采用t检验。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠空腹血糖比较表1结果显示：造模前，各组大鼠空腹血糖比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。造模后，模型组，半夏泻心汤低、中、高剂量组和二甲双胍组大鼠空腹血糖值较空白组均升高（P＜0.05）。给药干预后，半夏泻心汤低、中、高剂量组和二甲双胍组大鼠空腹血糖均低于模型组（P＜0.05），且半夏泻心汤各组呈剂量依赖性；半夏泻心汤高剂量组大鼠空腹血糖与二甲双胍组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组大鼠不同时间点空腹血糖比较Table 1 Comparison of fasting blood glucose among various groups of rats at different time points （±s）

表1 各组大鼠不同时间点空腹血糖比较Table 1 Comparison of fasting blood glucose among various groups of rats at different time points （±s）

①P＜0.05，与正常组比较；②P＜0.05，与模型组比较；③P＜0.05，与二甲双胍组比较

组别空白组模型组半夏泻心汤低剂量组半夏泻心汤中剂量组半夏泻心汤高剂量组二甲双胍组F值P值鼠数/只10 10 10 10 10 10空腹血糖/（mmol·L-1）造模前5.12±1.01 5.23±1.03 5.18±1.02 5.10±1.03 5.08±1.04 5.21±1.02 0.036 42 0.999 20造模后5.01±1.02 24.63±3.45①25.72±3.51①25.01±3.62①24.88±3.73①24.71±4.01①57.79＜0.000 1给药后5.08±1.05 23.15±3.12①20.02±2.87①②③16.27±2.31①②③7.36±1.28①②7.23±1.24①②126.4＜0.000 1

2.2 各组大鼠Morris水迷宫试验结果比较表2结果显示：与空白组比较，模型组大鼠逃避潜伏期显著延长，穿越目标区次数明显减少（P＜0.05）；半夏泻心汤低、中、高剂量组和二甲双胍组大鼠逃避潜伏期均短于模型组，穿越目标区次数高于模型组（P＜0.05），且半夏泻心汤各组呈剂量依赖性；半夏泻心汤高剂量组逃避潜伏期和穿越目标区次数与二甲双胍组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 各组大鼠逃避潜伏期和穿越目标区次数比较Table 2 Comparison of escape latency and frequency of crossing the target area among various groups of rats （±s）

表2 各组大鼠逃避潜伏期和穿越目标区次数比较Table 2 Comparison of escape latency and frequency of crossing the target area among various groups of rats （±s）

①P＜0.05，与正常组比较；②P＜0.05，与模型组比较；③P＜0.05，与二甲双胍组比较

组别空白组模型组半夏泻心汤低剂量组半夏泻心汤中剂量组半夏泻心汤高剂量组二甲双胍组F值P值鼠数/只10 10 10 10 10 10逃避潜伏期/s 12.01±2.18 35.26±5.24①30.42±4.06①②③23.67±3.56①②③14.25±2.67①②14.83±2.75①②72.84＜0.0001穿越目标区次数/次8.13±1.25 2.05±0.73①3.46±0.82①②③5.27±0.96①②③7.05±1.10①②7.08±1.11①②54.67＜0.0001

2.3 各组大鼠血清中CD4+、CD8+T细胞比例及CD4+/CD8+比值表达比较表3结果显示：与空白组比较，模型组大鼠血清中CD8+T细胞比例升高，CD4+T细胞比例和CD4+/CD8+比值均显著降低（P＜0.05）；半夏泻心汤低、中、高剂量组和二甲双胍组大鼠血清中CD8+T细胞比例低于模型组，CD4+T细胞比例和CD4+/CD8+比值均高于模型组（P＜0.05），且半夏泻心汤各组呈剂量依赖性；半夏泻心汤高剂量组大鼠血清中CD8+T细胞比例、CD4+T细胞比例和CD4+/CD8+比值与二甲双胍组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表3 各组大鼠血清中CD4+、CD8+T细胞比例及CD4+/CD8+比值表达比较Table 3 Comparison of the proportion of CD4+，CD8+T cells in serum and the ratio of CD4+/CD8+among various groups of rats （±s）

表3 各组大鼠血清中CD4+、CD8+T细胞比例及CD4+/CD8+比值表达比较Table 3 Comparison of the proportion of CD4+，CD8+T cells in serum and the ratio of CD4+/CD8+among various groups of rats （±s）

①P＜0.05，与正常组比较；②P＜0.05，与模型组比较；③P＜0.05，与二甲双胍组比较

组别空白组模型组半夏泻心汤低剂量组半夏泻心汤中剂量组半夏泻心汤高剂量组二甲双胍组F值P值鼠数/只10 10 10 10 10 10 CD8+T细胞比例/%24.31±2.43 38.26±3.81①35.18±3.42①②③31.42±3.15①②③28.01±2.73①②27.89±2.67①②28.31＜0.000 1 CD4+T细胞比例/%23.08±2.36 15.31±1.72①17.26±1.93①②③19.36±2.01①②③21.58±2.18①②21.37±2.15①②20.14＜0.000 1 CD4+/CD8+比值0.85±0.23 0.42±0.12①0.56±0.16①②③0.62±0.18①②③0.73±0.21①②0.75±0.22①②6.510＜0.000 1

2.4各组大鼠脑组织自噬相关蛋白LC3、Beclin-1表达比较图1结果显示：与空白组比较，模型组LC3-Ⅱ/LC3-Ι比值和Beclin-1蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）；半夏泻心汤低、中、高剂量组和二甲双胍组LC3-Ⅱ/LC3-Ι比值和Beclin-1蛋白表达水平均低于模型组（P＜0.05），且半夏泻心汤各组呈剂量依赖性；半夏泻心汤高剂量组LC3-Ⅱ/LC3-Ι比值和Beclin-1蛋白表达水平与二甲双胍组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

图1 各组大鼠脑组织自噬相关蛋白LC3、Beclin-1表达比较Figure 1 Comparison of the expression of autophagy-related proteins LC3 and Beclin-1 among various groups of rats（±s）

2.5 各组大鼠肠道菌群多样性分析结果比较表4结果显示：与空白组比较，模型组大鼠肠道菌群多样性分析中的Chao 1指数和Shannon指数均显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，半夏泻心汤低、中、高剂量组和二甲双胍组Chao 1指数和Shannon指数均不同程度增加（P＜0.05），且半夏泻心汤各组呈剂量依赖性；半夏泻心汤高剂量组Chao 1指数和Shannon指数与二甲双胍组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表4 各组大鼠Chao 1指数和Shannon指数比较Table 4 Comparison of Chao 1 index and Shannon index among various groups of rats （±s）

表4 各组大鼠Chao 1指数和Shannon指数比较Table 4 Comparison of Chao 1 index and Shannon index among various groups of rats （±s）

①P＜0.05，与正常组比较；②P＜0.05，与模型组比较；③P＜0.05，与二甲双胍组比较

组别空白组模型组半夏泻心汤低剂量组半夏泻心汤中剂量组半夏泻心汤高剂量组二甲双胍组F值P值鼠数/只10 10 10 10 10 10 Chao 1指数511.42±65.18 372.15±102.47①415.38±93.24①②③486.27±81.05①②③542.36±68.31①②536.29±69.15①②7.252＜0.0001 Shannon指数5.61±0.81 4.23±0.45①4.87±0.61①②③5.25±0.83①②③6.31±1.02①②6.45±1.03①②10.83＜0.0001

2.6 各组大鼠菌落的群落结构比较图2-A结果显示：门水平上，与空白组比较，模型组的厚壁菌门（Firmicutes）丰度显著降低，拟杆菌门（Bacteroidetes）丰度显著增加，厚壁菌门/拟杆菌门的比值显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，半夏泻心汤低、中、高剂量组和二甲双胍组厚壁菌门丰度均不同程度增加，拟杆菌门丰度不同程度降低，厚壁菌门/拟杆菌门的比值增加（P＜0.05）。

图2-B结果显示：属水平上，模型组普氏菌属（Prevotella）、瘤胃球菌属（Ruminococcus）丰度高于空白组，乳酸杆菌属（Lactobacillus）、密螺旋体属（Treponema）丰度低于空白组（P＜0.05）；半夏泻心汤低、中、高剂量组和二甲双胍组普氏菌属、瘤胃球菌属丰度低于模型组，乳酸杆菌属、密螺旋体属丰度高于模型组（P＜0.05），且半夏泻心汤各组呈剂量依赖性；半夏泻心汤高剂量组普氏菌属、瘤胃球菌属、乳酸杆菌属、密螺旋体属丰度与二甲双胍组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

图2 各组大鼠菌落的群落结构比较Figure 2 Comparison of community structure of bacterial colony among various groups of rats

2.7 各组大鼠脑组织中PKA、CREB mRNA表达比较图3结果显示：模型组PKA、CREB mRNA表达水平低于空白组（P＜0.05）；半夏泻心汤低、中、高剂量组和二甲双胍组中PKA、CREB mRNA表达水平高于模型组（P＜0.05），且半夏泻心汤各组呈剂量依赖性；半夏泻心汤高剂量组PKA、CREB mRNA表达水平与二甲双胍组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

图3 各组大鼠脑组织中PKA、CREB mRNA表达比较Figure 3 Comparison of mRNA expression of PKA and CREB in brain tissues among various groups of rats

3 讨论

近年来，肠道菌群和中枢神经系统疾病的关系逐渐成为科学领域研究的热点，并提出了肠道与大脑之间存在“肠道菌群-肠-脑轴”。肠道菌群可通过迷走神经、内分泌等途径参与中枢神经系统进行交流，从而影响大脑功能和行为；反之，大脑也可以通过迷走神经等多种途径影响肠道菌群[13]。而肠道菌群与2型糖尿病等代谢性疾病发病密切相关。有研究表明，糖尿病潜在机制与肠道菌群丰度和多样性的变化有关[8]。故推测，肠道菌群-肠-脑轴可能是研究糖尿病认知功能障碍机制及干预作用的有效切入点。因此，本研究基于肠道菌群-肠-脑轴探讨半夏泻心汤对糖尿病认知功能障碍大鼠的影响。

半夏泻心汤主治寒热错杂之痞证，其辛开苦降的配伍思想顺应了脾胃的生理特性，通过调节脾胃气机升降而恢复脾胃功能，使机体的物质代谢恢复正常。半夏泻心汤是助脾散精法的代表方剂之一，其中：半夏可辛温散热；黄芩、黄连苦寒清降；人参、大枣、炙甘草等合用以恢复中焦气机合畅，收聚离经之精。全方升降同用，甘苦同施，达到助脾与散精兼顾[14]。本研究结果表明，糖尿病认知功能障碍大鼠有较严重的菌群失调、免疫功能下降，半夏泻心汤能改善糖尿病认知功能障碍大鼠肠道微生态环境，促进益生菌的增殖，减少致病菌水平，并能提高机体免疫功能（增加血清CD8+T细胞比例，降低CD4+T细胞比例和CD4+/CD8+比值）。

Morris水迷宫试验是较为公认的神经认知功能和记忆改善治疗效果评估手段之一[15]。本研究结果显示，模型组大鼠Morris水迷宫试验逃避潜伏期增加，穿越目标区次数减少，而经半夏泻心汤干预后大鼠的逃避潜伏期缩短，穿越目标区次数增多，表明半夏泻心汤可提高糖尿病认知功能障碍大鼠记忆能力，改善认知功能障碍症状，且与二甲双胍效果相当。

细胞自噬在认知功能障碍机制中发挥重要作用。研究表明，神经元自噬异常会破坏细胞稳态，严重时可影响患者的认知功能；而通过调控神经细胞自噬信号通路可明显改善细胞缺氧，促进能量及物质代谢，改善认知功能[16]。既往研究发现，糖尿病小鼠海马神经元自噬增强[17]。自噬对应激状态下神经细胞存活、清除神经细胞内衰老细胞器和错误折叠蛋白等起重要作用；其可作为神经细胞的保护机制，也可作为神经细胞死亡方式之一[18]。本研究结果表明，半夏泻心汤可抑制糖尿病认知功能障碍大鼠神经细胞自噬的过度激活（下调脑组织自噬蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ι比值和Beclin-1蛋白表达），保护神经细胞功能。

蛋白激酶A（PKA）-环腺苷酸（cAMP）反应元件结合蛋白（CREB）信号转导通路在中枢神经系统中起关键作用，能促进神经细胞的再生和分化[19]。又有研究证实，PKA-CREB信号通路介导突触的可塑性和学习记忆功能。cAMP作为细胞内第二信使，通过活化PKA激活CERB，CREB激活后与环磷腺苷效应元件（CRE）结合，进而调节下游基因的转录，广泛参与神经系统的学习记忆过程[20]。CREB的活性对维持神经功能至关重要，其可调节突触可塑性、长期记忆的形成和神经元存活[21]。本研究结果表明，半夏泻心汤可能通过增强糖尿病认知功能障碍大鼠脑组织中PKA、CREB的基因表达，影响了海马突触可塑性，从而改善糖尿病大鼠认知功能。

综上所述，半夏泻心汤可改善大鼠糖尿病认知功能障碍，其机制可能与调节肠道菌群，增强细胞免疫功能，并抑制神经细胞自噬、激活脑组织PKA-CREB信号通路进而保护神经功能有关。