汉黄芩苷抗糖尿病大鼠肾损伤及纤维化的机制研究

柯亚琼，郝建波，芦玲，陈淅泠，付艳芹

（1.郑州大学第二附属医院老年医学科二病区，河南郑州 450000；2.郑州大学第二附属医院内分泌科，河南郑州 450000）

糖尿病肾病（diabetic kidney disease）作为糖尿病的一种微血管并发症，是终末期肾衰竭的主要原因，早期预防糖尿病肾脏损伤十分重要[1-3]。转化生长因子β1（TGF-β1）是一种已知的促纤维化细胞因子。研究表明，临床糖尿病肾病患者血清TGF-β1水平异常增高与蛋白尿程度密切相关[4]。TGF-β1/丝裂原活化蛋白激酶p38（p38MAPK）信号通路激活可诱导急性肾损伤和肾纤维化，抑制该通路被认为是减轻肾脏损伤的途径之一[5]。汉黄芩苷（wogonoside）为类黄酮单体，是中药黄芩（为唇形科黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的根）的主要成分之一[6]，具有抗炎[7]、抗肿瘤[8]、抗氧化[9]等药理活性。既往有研究表明，汉黄芩苷可减轻糖尿病肾病肾组织炎症[10]，提示汉黄芩苷对糖尿病并发肾组织损伤有治疗作用。本研究拟建立糖尿病大鼠模型，进一步探讨汉黄芩苷是否可通过抑制TGF-β1/p38MAPK信号通路发挥抗糖尿病大鼠肾损伤及纤维化的作用。又因细胞周期素依赖性蛋白激酶5（CDK5）与胰岛β细胞损伤和胰岛素分泌不足有关，Roscovitine作为CDK5的抑制剂，已被证实可通过抑制TGF-β1/p38MAPK途径发挥抗糖尿病小鼠肾纤维化的作用[11]，故以Roscovitine治疗为阳性对照。现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物清洁级8周龄雄性SD大鼠50只，体质量为（180±20）g，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK（鲁）2019-0003。本研究方案已经郑州大学第二附属医院伦理委员会审核通过（批号：ZZDXDEFSYY2019009）。研究过程遵循实验动物人道主义及3R原则。饲养环境：24℃恒温普通饲养，12 h/12 h光暗交替。

1.2 药物、试剂与仪器汉黄芩苷（分子量：460.388；分子式：C22H20O11），纯度≥98%，上海吉至生化科技有限公司生产，批号：51059-44-0。链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）、CDK5抑制剂Roscovitine（美国Sigma公司）；尿白蛋白（albumin，Alb）酶联免疫吸附分析（ELISA）试剂盒（上海江莱生物技术有限公司）；α平滑肌肌动蛋白（αsmooth muscle actin，α-SMA）、TGF-β1、Ⅳ型胶原蛋白（collagenⅣ，ColⅣ）、p38MAPK、GAPDH等抗体（美国Abcam公司）；磷酸化p38丝裂原活化蛋白酶（p-p38MAPK）抗体（美国CST公司）；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG二抗（武汉艾美捷生物科技有限公司）；苏木素-伊红（HE）染色试剂盒、马松（Masson）三色染色试剂、ECL Plus超敏发光液试剂盒（北京索莱宝生物科技有限公司）；全蛋白提取试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司）。iBright成像系统[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]；全自动生化分析仪（瑞士巴塞尔罗氏诊断公司）；多功能酶标仪（美国赛默飞世尔科技有限公司）。

1.3 造模、分组与给药将50只大鼠适应性喂养1周后，根据随机数字表取10只作为正常组常规饲养，剩余40只给予高脂饲料喂养6周后用于构建2型糖尿病模型。方法[12]：造模前禁食12 h，STZ溶于0.1 mol/L枸橼酸缓冲液（pH 4.0）中，每天腹腔单次注射30 mg/kg STZ（以枸橼酸缓冲液稀释），正常组腹腔注射等体积枸橼酸缓冲液。3 d后尾尖采血测定大鼠血糖，若随机血糖浓度≥16.7 mmol/L，则判断建模成功。继续2周自由饮食饲养后，再次测量血糖证实糖尿病大鼠模型成功与否，期间无大鼠死亡。最后将造模成功的大鼠随机分为4组，即模型组，汉黄芩苷低、高剂量组，Roscovitine对照组，每组10只。按照动物和人用药剂量换算关系确定大鼠的等效剂量相当于人的6.17倍[13]，汉黄芩苷低、高剂量组分别给予汉黄芩苷[用二甲基亚砜（DMSO）溶解]10、40 mg·kg-1·d-1腹腔注射[10]，Roscovitine对照组给予Roscovitine（用DMSO溶解）40 mg·kg-1·d-1腹腔注射[11]，模型组和正常组腹腔注射等体积DMSO，连续给药时间为10周。

1.4 观察指标与方法

1.4.1 观察大鼠一般状态 包括精神状态、毛色、饮食、排便、活动、体质量等。

1.4.2 标本采集与处理 末次干预后，将大鼠放置于单独的代谢笼里，收集尿液，以检测24 h尿Alb含量。后禁食12 h，经大鼠尾静脉取血，检测血糖值。后用戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉大鼠，腹主动脉取血，离心分离血清，用于空腹血糖与肾脏功能相关指标的测定。后处死大鼠，取出肾脏，统一将左肾置于4%的多聚甲醛中固定24 h用于组织学检查，右肾保存于液氮内用于组织蛋白质的提取。

1.4.3 血糖和肾功能指标检测 取血清，应用全自动生化分析仪测定大鼠空腹血糖（FBG）、血肌酐（SCr）和血尿素氮（BUN）。取尿液，严格按照ELISA试剂盒说明书测定大鼠尿Alb水平。

1.4.4 肾组织病理学观察 石蜡包埋的肾组织切片（4μm）经脱蜡、水化后，根据染色试剂盒说明书步骤进行常规HE染色和Masson染色，显微镜观察并照相，评估肾小球硬化和肾小管间质病变。

1.4.5 蛋白免疫印迹（Western Blot）实验 取液氮保存的肾脏组织，研钵碾碎后收集并加入预冷的放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解液，混匀后离心，以12 000 g离心20 min，取上清。二喹啉甲酸（BCA）法测定蛋白质浓度，统一浓度后进行蛋白变性。加样，经十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），10%SDS凝胶上分离等量的蛋白（100μg）并转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，后将膜于5%脱脂乳中，37℃封闭2 h，于稀释后的 一 抗ColⅣ、α-SMA、TGF-β1、p-p38MAPK、p38MAPK、GAPDH（均1∶500稀释）中4℃孵育过夜。次日，TBST洗膜90 min（换液3～6次）后于25℃摇床孵育二抗（均1∶8 000稀释）2 h，TBST洗膜90 min（换液3～6次），PVDF膜于暗处浸润ECL显影试剂2～3 min，利用化学发光凝胶成像系统拍照记录。采用ImageJ软件分析条带灰度值，结果以目的蛋白与内参GAPDH的灰度值比值表示。

1.5 统计方法采用SPSS 22.0软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般状态比较给药治疗过程中，正常组大鼠精神状态良好，饮食、排便无异常，活动自如，反应力良好，皮毛色泽自然；模型组大鼠表现出烦渴、多食和多尿的症状，消瘦，行动迟缓，精神状态较差，皮毛色暗、毛糙无光泽；与模型组比较，汉黄芩苷低、高剂量组及Roscovitine对照组大鼠上述症状均明显好转。表明汉黄芩苷对糖尿病大鼠临床症状具有一定的改善作用。

2.2 各组大鼠血糖和肾功能指标比较表1结果显示：与正常组比较，模型组大鼠血清FBG、BUN、SCr及尿Alb水平均明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，汉黄芩苷低、高剂量组和Roscovitine对照组血清FBG、BUN、SCr及尿Alb水平显著降低（P＜0.05）；汉黄芩苷低、高剂量组血清FBG、BUN、SCr及尿Alb水平均高于Roscovitine对照组，其中，汉黄芩苷高剂量组血清FBG和SCr水平的差异均无统计学意义（P＞0.05）。表明糖尿病大鼠模型存在肾功能损害，而汉黄芩苷可改善糖尿病大鼠血糖水平及肾功能损害。

表1 各组大鼠血糖和肾功能指标比较Table 1 Comparison of blood glucose and renal function indexes among various groups of rats （±s）

表1 各组大鼠血糖和肾功能指标比较Table 1 Comparison of blood glucose and renal function indexes among various groups of rats （±s）

①P＜0.05，与正常组比较；②P＜0.05，与模型组比较；③P＜0.05，与Roscovitine对照组比较

组别正常组模型组汉黄芩苷低剂量组汉黄芩苷高剂量组Roscovitine对照组F值P值鼠数/只10 10 10 10 10 FBG/（mmol·L-1）6.9±0.48 24.29±3.15①18.12±2.73②③9.46±1.91②8.34±1.29②166.702＜0.001 BUN/（mmol·L-1）9.37±0.65 26.24±3.87①19.75±2.06②③13.13±1.84②③11.39±1.20②133.939＜0.001 SCr/（μmol·L-1）25.15±2.63 80.65±6.78①61.26±4.12②③37.26±3.24②34.48±3.95②366.063＜0.001 Alb/（mg·L-1）5.87±0.37 26.14±3.12①19.15±2.67②③11.23±1.91②③9.17±1.12②210.420＜0.001

2.3 各组大鼠肾脏组织HE染色结果比较图1结果显示：正常组大鼠肾小球形状规则、结构完整，肾小管上皮细胞排列整齐，肾脏无纤维组织增生及基底膜增厚，系膜细胞和基质无增殖；模型组出现了明显肾间质损伤，可见炎症细胞浸润，肾小管管腔扩张，系膜基质增多，基底膜增厚，基底细胞增生；与模型组比较，汉黄芩苷低剂量组肾组织病理损伤改善轻微，而汉黄芩苷高剂量组肾组织病理损伤得到了较大程度的改善，且与Roscovitine对照组结果相似。表明糖尿病大鼠模型存在肾组织病理损伤，而汉黄芩苷可减轻糖尿病大鼠肾组织病理损伤。

图1 各组大鼠肾脏组织HE染色结果比较（×200）Figure 1 Comparison of HE staining results of rat renal tissues among various groups（×200）

2.4 各组大鼠肾脏组织Masson染色结果比较图2结果显示：正常组大鼠肾组织基本正常，无胶原纤维蓝色染色；模型组大鼠肾间质和肾小球的胶原纤维蓝色染色较深，蛋白沉积显著增加，肾纤维化严重；汉黄芩苷低、高剂量组及Roscovitine对照组大鼠肾小球及肾间质胶原纤维蓝色染色较模型组变浅。表明糖尿病大鼠模型存在肾纤维化，而汉黄芩苷可减轻糖尿病大鼠肾纤维化。

图2 各组大鼠肾组织Masson染色结果比较（×200）Figure 2 Comparison of Masson staining results of rat renal tissues among various groups（×200）

2.5 各组大鼠肾组织TGF-β1、p38MAPK、pp38MAPK、α-SMA及ColⅣ蛋白表达比较表2、图3结果显示：与正常组比较，模型组肾组织TGF-β1、p38MAPK、p-p38MAPK、α-SMA及ColⅣ蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，汉黄芩苷低、高剂量组及Roscovitine对照组肾组织TGF-β1、p38MAPK、p-p38MAPK、α-SMA及ColⅣ的蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）；汉黄芩苷低、高剂量组肾组织TGF-β1、p38MAPK、p-p38MAPK、α-SMA及ColⅣ蛋白表达水平均高于Roscovitine对照组，其中，汉黄芩苷高剂量组的α-SMA及ColⅣ蛋白表达水平的差异无统计学意义（P＞0.05）。表明汉黄芩苷可抑制糖尿病大鼠肾组织纤维化相关蛋白的表达及TGF-β1/p38MAPK通路的活化。

表2 各组大鼠肾组织转化生长因子β1（TGF-β1）、丝裂原活化蛋白激酶p38（p38MAPK）、磷酸化p38MAPK（p-p38MAPK）、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）及Ⅳ型胶原蛋白（ColⅣ）蛋白表达水平比较Table 2 Comparison of protein expression levels of TGF-β1，p38MAPK，p-p38MAPK，α-SMA and ColⅣin rat kidney tissues among various groups （±s）

表2 各组大鼠肾组织转化生长因子β1（TGF-β1）、丝裂原活化蛋白激酶p38（p38MAPK）、磷酸化p38MAPK（p-p38MAPK）、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）及Ⅳ型胶原蛋白（ColⅣ）蛋白表达水平比较Table 2 Comparison of protein expression levels of TGF-β1，p38MAPK，p-p38MAPK，α-SMA and ColⅣin rat kidney tissues among various groups （±s）

①P＜0.05，与正常组比较；②P＜0.05，与模型组比较；③P＜0.05，与Roscovitine对照组比较

组别正常组模型组汉黄芩苷低剂量组汉黄芩苷高剂量组Roscovitine对照组F值P值鼠数/只10 10 10 10 10 TGF-β1 0.18±0.02 1.15±0.11①0.96±0.10②③0.45±0.11②③0.36±0.08②285.308＜0.001 p38MAPK 0.21±0.02 1.21±0.21①0.91±0.08②③0.42±0.07②③0.35±0.06②204.559＜0.001 p-p38MAPK 0.17±0.03 1.12±0.13①0.87±0.07②③0.38±0.09②③0.32±0.06②322.456＜0.001 α-SMA 0.30±0.04 1.18±0.23①0.89±0.09②③0.39±0.10②0.37±0.08②130.284＜0.001 ColⅣ0.29±0.05 1.13±0.14①0.92±0.1②③0.38±0.07②0.37±0.08②227.323＜0.001

图3 各组大鼠肾组织转化生长因子β1（TGF-β1）、丝裂原活化蛋白激酶p38（p38MAPK）、磷酸化p38MAPK（p-p38MAPK）、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）及Ⅳ型胶原蛋白（ColⅣ）的Western Blot电泳条带图Figure 3 Western Blot electrophoresis bands of TGF-β1，p38MAPK，p-p38MAPK，α-SMA and ColⅣin rat kidney tissues among various groups

3 讨论

病理条件下，糖尿病的高血糖启动和激活一系列复杂过程，伴有大量细胞（包括间质成纤维细胞、内皮细胞、管状细胞和周围细胞）和肌母细胞活化产生的基质蛋白如纤维连接蛋白、层黏连蛋白和Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ胶原蛋白等，可诱导糖尿病肾间质纤维化（tubulointerstitial fibrosis，TIF）[14]。TIF标志着不可逆性肾损伤，可作为肾脏生存期的最佳预测指标[11]，是各种肾脏疾病发展成为终末期肾衰竭的共同途径。BUN、SCr和Alb水平是评估早期肾功能的重要指标，白蛋白尿则是糖尿病肾脏损伤中最典型的临床症状之一。本研究结果显示，糖尿病模型大鼠FBG及尿Alb含量显著升高，提示成功建立糖尿病大鼠模型并伴有肾脏损伤；而经不同剂量汉黄芩苷及Roscovitine治疗后，大鼠FBG及尿Alb含量均显著降低，表明汉黄芩苷可有效改善糖尿病大鼠肾功能。汉黄芩苷为40 mg/kg剂量时具有与Roscovitine相似的疗效。

糖尿病肾脏损伤的病理标志包括肾小球和肾小管基底膜的增厚、肾小球硬化及TIF[15]，其中，TIF为关键性病理过程，被认为是导致肾小球和肾小管功能障碍及衰退的主要病理因素[16]，表现为肾间质成纤维细胞的增多和细胞外基质（ECM）尤其是大量胶原纤维如ColⅣ的过度沉积[17]。α-SMA为肌成纤维细胞的标志性蛋白，其表达过量时，会促进肾纤维化病理过程[18]。TGF-β1是TGF-β超家族的成员，是通过调节ECM合成参与肾脏纤维化的重要因子[19]，可诱导肾小管上皮细胞转分化为肌成纤维细胞。另外，TGF-β1作为通路上游因子可激活p38MAPK信号，p-p38MAPK为p38MAPK通路 中的关键信号分子，其表达增强是该信号通路激活的标志之一[20]。本研究结果显示，糖尿病模型大鼠肾脏组织发生明显病理损伤，可见肾小球增大、炎症细胞增多、基底膜弥漫性增厚、系膜处基质增多，肾纤维化程度严重，给予汉黄芩苷干预后，大鼠肾组织纤维化得到了明显改善，表明汉黄芩苷具有抗糖尿病肾损伤及纤维化的作用。本研究结果还显示，模型组肾组织TGF-β1及其下游信号因子p38MAPK的磷酸化水平和肾纤维化标志物α-SMA、ColⅣ均呈高表达，而汉黄芩苷低、高剂量组大鼠肾脏组织上述各分子指标表达水平均较模型组降低，且高剂量汉黄芩苷的治疗效果更显著，提示汉黄芩苷可能是通过抑制TGF-β1及其下游信号因子p38MAPK的活化，进而改善糖尿病大鼠肾纤维化。

综上所述，汉黄芩苷可有效改善糖尿病大鼠肾损伤及纤维化，其机制可能与抑制TGF-β1/p38MAPK信号通路的活化有关。