新型三嗪类药物沙咪珠利在感染柔嫩艾美耳球虫鸡体内不同浓度下药物动力学

付义凯，张丽芳，王春梅，王霄旸，费陈忠，张可煜，王 米，薛飞群，刘迎春

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

鸡球虫病每年给养鸡业造成了巨大的经济损失。根据统计，全世界每年饲养大约390亿只鸡，因鸡球虫病直接造成的经济损失可达到30亿英镑[1]。目前，鸡球虫病作为一种寄生性原虫病，研制疫苗对鸡很难进行全面保护，抗球虫药物仍然是防治畜禽球虫病的主要手段[2]。但是，随着这些药物被大量和重复使用，球虫耐药性逐渐显现，曾经被认为抗球虫药物中最有效的地克珠利（Diclazuril）也出现非常严重的耐药性问题[3-5]。为了更好的防治畜禽球虫病，应对耐药性的问题，最好的的办法是研制出全新的抗球虫药物。

沙咪珠利（Ethanamizuril，EZL）是中国农业科学院上海兽医研究所兽用抗感染药物创新团队在地克珠利和妥曲珠利的基础上自主研发的一种新型三嗪类抗球虫药。药效学研究表明沙咪珠利在临床使用中，低剂量下、抗球虫活性较高，具有成为新型抗球虫药物的潜力[6]。本研究通过建立的鸡球虫感染模型，灌胃不同剂量的沙咪珠利溶液，给药后于不同时间点进行心脏采血，血浆样品采用超高效液相色谱法进行检测，浓度数据利用DAS3.0软件进行分析，得到不同剂量下的药动学参数，为进一步合理使用沙咪珠利提供数据和理论支持。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 沙咪珠利（EZL）（由中国农业科学院上海兽医研究所制备），纯度不低于99.5%；妥曲珠利亚砜（TSO）（含量≥99%），购自上海维编科贸有限公司；色谱纯乙腈和甲醇购自美国Fisher公司；分析纯乙酸乙酯、正己烷购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器设备 超高效液相色谱仪（ACQUITYUPLC系列，美国Waters公司）；紫外检测器 （ACQUITY UPLC TUV 系列，美国Waters公司）；涡旋混合器（XW-OA，上海医科大学仪器厂）；超声仪（SCQ-250，上海声谱科学仪器厂）；离心机（An-ke LXJ-ⅡB，上海安亭科学仪器厂）；氮吹仪（美国Organomation Associates公司）；微量台式离心机（美国Thermo Scientific）；微孔滤膜：0.22 μm（SCAA104，上海安谱科学仪器有限公司）。

1.3 实验动物 1日龄三黄雏鸡购自上海阜稷生物科技有限公司，平地散养，一周后转至笼养，自由采食饮水，饲喂未添加任何药物的全价配合饲料。

1.4 溶液制备 准确称量10 mg沙咪珠利和10 mg妥曲珠利亚砜，分别置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，分别得到1 mg/mL的沙咪珠利和妥曲珠利亚砜储备液，置4℃冰箱中密封保存。取适量储备液，用甲醇稀释至所需浓度为不同浓度标准工作液。

1.5 给药和样品采集 健康幼龄雏鸡200只，选取160只，体重120～160g，于15日龄时感染柔嫩艾美尔球虫孢子化卵囊80 000。感染后分别选取75只感染模型于第5 d分别灌胃给药沙咪珠利4 mg/kg.bw与8 mg/kg.bw。感染鸡给药前后分别于0、0.5、1、2、3、4、6、8、12、24、36、48、60、72 h，每个时间点取5只鸡心脏采血2 mL，离心分离血浆，血浆样品-20℃保存待测。

1.6 血浆中沙咪珠利含量测定方法

1.6.1 色谱条件 色谱柱：BEH C18柱（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）；流动相：色谱纯乙腈（A），0.1%甲酸水（B），采用梯度洗脱（见表1）；流速：0.2 mL/min；柱温：30℃；检测波长251 nm，运行10 min。

表1 UPLC 梯度洗脱条件Table 1 The gradientelution program of the UPLC-CV method

1.6.2 样品前处理 试验前，将待测样品取出，放置室温解冻。取200 μL血浆样品至1.5 mL离心管中，加入10 μL的40 μg/mL妥曲珠利亚砜（TSO）作为内标，涡旋混匀。然后加入1.2 mL乙酸乙酯涡旋30 s，进行提取。涡旋后10 000 ×g离心10 min，将上清液转移至另一个2 mL离心管中，60℃水浴氮气吹干，残渣用200 μL的30%乙腈水进行复溶，涡旋混匀后，10 000 ×g离心10 min，上清液过0.22 μm滤膜，进样测定。

1.6.3 标准曲线的测定 取200 μL的空白血浆置于1.5 mL离心管中，添加系列浓度的沙咪珠利标准工作液10 μL，使沙咪珠利浓度分别为0.04、0.1、0.5、1、5、10 μg/mL，按照1.6.2样品前处理方法处理，进样确定，记录色谱图中的EZL和TSO的峰面积，以样品中的EZL的浓度为横坐标，以沙咪珠利和妥曲珠利亚砜的峰面积的比值为纵坐标，绘制标准曲线。

1.6.4 回收率与精密度的测定 取200 μL的空白血浆，添加沙咪珠利标准溶液各10 μL，使样品浓度分别为低、中和高三组，每种浓度5个平行样品，样品浓度分别为0.1、1、5 mg/L，按照1.6.2方法进行处理，进样测定。样品的相对回收率根据当天的制备的标准曲线计算。精密度包括日内和日间精密度，精密度用日内和日间的标准偏差（s）或者相对标准偏差（relative standard deviation, RSD）表示。

1.6.5 样品稳定性的测定 制备样品浓度为1、4 μg/ml，分两组，第一组室温，添加标准溶液的血浆样品放置8 h后，按照1.6.2中的方法处理并进样测定，记录EZL和TSO的峰面积；第二组是将样品放置到-20℃冰箱中，保存24 h后取出，自然解冻，解冻后再次将血浆样品放置-20℃冰箱，如此反复3次后，进行样品处理后测定，记录EZL和TSO的峰面积，通过标准曲线方程计算出相对回收率。

1.7 数据处理 根据沙咪珠利的血浆标准曲线计算两药在各采样时间点血浆中药物浓度，用DAS3.0软件对血药浓度－时间数据进行拟合，用非房室模型分析药动学参数。

2.结果

2.1 血浆中沙咪珠利测定方法的建立

2.1.1 检测方法的专属性 空白鸡血浆与空白鸡血浆添加沙咪珠利（EZL）、妥曲珠利亚砜（TSO）后，按1.6.2中方法处理后，经UPLC进样检测，比较空白血浆和添加药物血浆色谱图。由图可知，沙咪珠利（EZL）和妥曲珠利亚砜（TSO）在出峰处无干扰，方法专属性良好（图1）。

图1 血浆中沙咪珠利和妥曲珠利亚砜色谱图Fig.1 Chromatograms of EZL and TSO

2.1.2 标准曲线和线性范围 分别以药物浓度（X）和EZL峰面积/TSO峰面积比值（Y）进行统计回归，得到鸡血浆回归方程为y=0.8532x-0.0337，R²=0.9998。根据标准曲线可知血浆中沙咪珠利在0.04～10 μg/mL的范围内线性关系良好。

2.1.3 回收率及精密度 空白鸡血浆中分别添加高、中、低3个浓度沙咪珠利标准工作液，每个浓度平行测定5个样品，连续测定3 d，计算回收率及精密度结果（表2）。由结果可知，血浆回收率为90.19%～116.72%，日内精密度为1.62%～8.57%、2.64%～7.41%。方法的回收率及精密度良好，符合生物样品的测定要求。

表2 鸡血浆中沙咪珠利含量检测准确度和精密度Table 2 Recovery and precision results of Ethanamizuril in chicken plasma

2.1.4 样品稳定性 本试验考察了2个浓度的鸡血浆样品在8 h和3次反复冻融后稳定性。添加浓度为1 μg/mL、4 μg/mL的样品放置8 h后回收率分别为98.14±4.78和93.64±5.05；两种浓度的样品反复冻融3次后回收率分别为113.02±2.49和112.66±7.89。结果表明，血浆样品在此种条件下稳定性良好。

2.2 沙咪珠利在感染鸡体内的药动学特征 空白健康雏鸡饲养至15 d龄感染柔嫩艾美尔球虫孢子化卵囊80 000，给药剂量分别为4 mg/kg.bw、8 mg/kg.bw，灌胃给药。给药前后分别于0、0.5、1、2、3、4、6、8、12、24、36、48、60、72 h时间点采血。4 mg/kg与8 mg/kg剂量下，血药浓度-时间曲线如图2所示，两种给药剂量下血浆中不同时间点对应的平均药物浓度见表3。用DAS3.0药动学软件非房室模型对浓度数据进行拟合，药动学参数见表4。通过灌胃给药，给药剂量分别为4 mg/kg.bw与8 mg/kg.bw，按不同时间点采血，通过DAS3.0软件非房室模型拟合，获得4 mg/kg和8 mg/kg给药后的药代动力学参数，分析数据得到药时曲线面积AUC（mg L-1h）为96.90±16.31、351.61±36.06；平均滞留时间MRT（h）为21.80±1.80、23.86±2.12；药物半衰期t1/2z（h）为13.83±5.13、15.07±7.49；药物达峰时间Tmax（h）为5.2±3.83、8.8±1.79，药物达峰浓度Cmax（mg L-1）为4.28±1.56、11.82±0.59。

表3 鸡分别单剂量给药4 mg/kg.bw，8 mg/kg.bw后不同时间点时鸡血浆中沙咪珠利平均药物浓度Table 3 The mean concentrations of EZL in poultry plasma after oral administration of 4 mg/kg.bw，8 mg/kg.bw,respectively

表4 鸡灌胃4 mg/kg.bw，8 mg/kg.bw药物代谢动力学参数Table 4 Pharmacokinetic parameters EZL in chicken plasma after administration at the dosage of 4 mg/kg.bw, 8 mg/kg.bw

图2 血浆中沙咪珠利药物浓度-时间曲线图Fig.2 The concentration time curve of EZL in chicken plasma

3 讨论

药物代谢动力学（Pharmacokinetics, PK）研究的是给药后药物在机体内的排泄以及代谢规律，借助数学模型计算出药动学参数来预测药物在体内的过程[7]。药物的体内过程包括吸收（Absorption）、分布（Distribution）、代谢（Metabolism）、消除（Elimination）、排泄（Excretion），通过检测和分析手段，得到体内药物的含量和质量随时间的变化规律，最终得到各种药代动力学相关的参数和代谢相关信息，为药物的制剂研究，药理毒理研究等提供理论和数据支撑[8-9]。本实验通过建立鸡球虫感染模型，灌胃给药，给药剂量分别为4 mg/kg.bw与8 mg/kg.bw，按不同时间点采血，通过DAS3.0软件非房室模型拟合，获得4 mg/kg和8mg/kg给药后的药代动力学参数，分析数据得到药时曲线面积AUC （mg L-1h）为96.90、371.45；药物半衰期t1/2z为13.83 h和15.07 h；药物达峰时间Tmax分别为5.2 h和8.8 h，药物达峰浓度Cmax分别为4.28 μg/mL和11.82 μg/mL。研究表明，两种给药剂量下最高血药浓度，药时曲线下面积值与给药剂量呈正相关，说明沙咪珠利对鸡给药后在其体内吸收良好。两种剂量下消除半衰期相近，有文献报道，对鸡单剂量10 mg/kg灌胃给药地克珠利后，药物半衰期t1/2z为24.2 h，大于沙咪珠利在鸡体内的消除半衰期，说明沙咪珠利对鸡给药后在鸡体内消除更快[10]；Myoung-Seok等[11]报道鸡以单剂量10 mg/kg或20 mg/kg给药妥曲珠利后，妥曲珠利的最终代谢产物妥曲珠利亚砜在鸡体内的消除半衰期分别比妥曲珠利慢80.3 h和82.9 h，表明妥曲珠利对鸡给药后在体内的消除更慢。总之，研究结果表明对鸡给药后，沙咪珠利与地克珠利和妥曲珠利相比，在鸡体消除更快。