龙岩市猪结肠小袋纤毛虫和猪囊等孢球虫的Mini-Flotac方法检测

杨 飞 ，覃 果 ，黄翠琴

（1.西藏农牧学院动物科学学院，林芝 860000；2.龙岩学院生命科学学院 福建省家畜传染病防治与生物技术重点实验室，龙岩 364012）

目前，我国猪寄生虫病研究呈现上升的趋势，诸多研究表明寄生虫病是威胁猪养殖业的主要传染病之一，特别是肠道寄生虫病。肠道寄生虫又叫肠道内寄生虫，主要寄生于盲肠和结肠，猪感染肠道寄生虫后伴随腹泻、腹痛、厌食、结膜炎、肠炎等症状[1]，导致患畜体型消瘦、贫血、脱水，

甚至到后期出现呼吸神经症状，甚至导致病患死亡[2]。寄生于猪肠道的寄生虫主要有原虫、绦虫、线虫和吸虫。目前大部分猪场的驱虫方案只是针对线虫类寄生虫，对原虫类寄生虫由于其生活史很短，难于完全控制，其中猪结肠小袋纤毛虫（B.coli）感染的症状不是很明显，也是人结肠小袋纤毛虫病的主要感染来源[3]。猪囊等孢球虫（C.suis）感染常见于母猪与仔猪，引发哺乳仔猪肠炎和腹泻的流行，造成了全球范围猪产业经济损失严重[4]。

本次研究以龙岩部分猪场为对象，采用Mini-Flotac检测法对不同规模、不同年龄阶段的猪粪便进行寄生虫虫卵或卵囊检测，分析其感染情况，以及流行特点，以期为有效防控猪场肠道寄生虫病提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集与保存 分别在龙岩新罗区、长汀、上杭、漳平地区（猪场1、猪场2、猪场3、猪场4）共采集1029份新鲜粪样，其中猪场1、2是规模化猪场，猪场3、4是中小型猪场。每个猪场按种公猪、后备母猪、怀孕母猪、哺乳母猪、哺乳仔猪、保育猪随机进行粪便采集，每份约30 g，置于一次性塑料袋中，并标注猪的不同年龄阶段、收集地点及日期。将样品分为两份，一份直接存放于4℃，用于虫卵检测，一份纯化后用2.5%重铬酸钾溶液进行猪囊等孢球虫卵囊体外培养至孢子化。

1.2 主要材料及试剂 载破片、Fill-Flotac、Mini-Flota（Univerity of naples federico II, made in Italy）、饱和NaCl溶液、蔗糖梯度溶液、2.5%重铬酸钾溶液，以上试剂均购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.3 直接涂片检测粪便寄生虫 取普通水1～2滴放于载玻片上，通过牙签挑取芝麻大小的被检粪便与之混匀，剔除粗粪渣，加上盖玻片镜检虫卵，若能在粪样中检测到虫卵或者卵囊，可判断该猪感染寄生虫。观察虫卵或卵囊的形状及内部结构，并测量其大小，根据相关资料对虫卵/卵囊加以鉴定。

1.4 Mini-Flotac检测粪便寄生虫 由Fill-Flotac和Mini-Flota装置构成。Fill-Flotac装置包括盖子与刻度容器瓶两个部件，盖子部分由收集器（均化器杆）和过滤器组成；Mini-Flotac装置包括基座和读取盘两个物理部件，以及旋转的钥匙和显微镜适配器两个附件。依照www.flotac.unina.it网站上的操作说明进行组件装配，样品处理及实验操作。对两个浮选室的卵囊数量进行计数，采用公式Oocysts per gramme /Eggs per gram of faeces(OPG/EPG)=两个浮选室的卵囊个数之和×150，即可得到每克粪便中的卵囊数。

1.5 孢子化卵囊的培养 将粪便中检测到的猪囊等孢球虫卵囊，用饱和NaCl溶液进行单卵囊分离，蔗糖浓度梯度溶液纯化后，将未孢子化卵囊在2.5%重铬酸钾溶液中于28℃恒温培养箱进行体外培养48 h，期间每隔6 h取出部分进行显微镜观察其孢子化的形态，测量猪囊等孢球虫的卵囊、胚孢子、孢子囊的大小及卵囊长度与卵囊宽度等，结合卵囊形态、孢子囊、子孢子的形态特征与个数，对其进行形态学鉴定。

2 结果

2.1 虫卵形态学观察结果 虫卵形态学观察结果表明，在100倍观察到猪结肠小袋纤毛虫滋养体滋养体形态呈椭圆形，清晰透明，有轻微的活动，其大小不一，全身覆有纤毛；在400倍观察到猪结肠小袋纤毛虫包囊，包囊近似圆形或者椭圆形，包囊由两层囊膜，一个大核一个小核构成，呈现淡黄色（图1）。

图1 猪场粪便中的部分寄生虫虫卵Fig.1 Some parasite eggs in pig manure

2.2 卵囊形态学观察结果 在400倍观察到猪囊等孢球虫未孢子化卵囊，卵囊呈球形或者亚球形，具有光滑的双层壁，囊里面存在的残渣由大小不一颗粒组成；将未孢子化的卵囊用饱和NaCl溶液分离，用蔗糖浓度梯度溶液纯化后，经2.5%重铬酸钾培养后的观察猪囊等孢球虫孢子化卵囊，该卵囊含有两个孢子囊，每个孢子囊含有四个子孢子，卵囊的每一个孢子囊可见两个子孢子和一个大圆形残体（图2）。

图2 猪场粪便中的部分寄生虫虫卵卵囊Fig.2 Egg sacs of some parasites in pig manure

2.3 不同猪场感染情况 Mini-Flotac漂浮法检测结果显示，4个猪场共1029份新鲜粪便样品，其中有457份为阳性样品，总的感染率为44.41.%，最低感染强度（OPG值）为150，最高感染强度达7800，表明福建龙岩地区部分猪场肠道寄生虫感染严重。其中规模化猪场感染率为41.83%（302/722）,普通猪场感染率为50.49%（155/307）；结肠小袋纤毛虫的总感染率为33.43%（344/1029），最高OPG值为7800，囊等孢球虫的总感染率为10.98%（113/1029），最高OPG值为5550，其中猪场1、4只感染了结肠小袋纤毛虫，猪场2、3主要为猪结肠小袋纤毛虫与猪囊等孢球虫的混合感染。各猪场肠道寄生虫感染率和感染强度见表1。

表1 不同猪场猪肠道寄生虫感染率及感染强度Table 1 Intestinal parasite infection rate and infection intensity of pigs in different pig farms

2.4不同年龄阶段感染情况 根据不同年龄阶段猪肠道寄生虫感染率及感染强度结果显示，6个年龄阶段共1029份新鲜粪便样品，每个年龄阶段猪结肠小袋纤毛虫均有感染，最高感染率为51.64%，最低感染强度（OPG值）为 150，最高达 7800；其中种公猪感染率为51.64%（63/122），最高OPG值3450；后备母猪感染率为20.00%（21/105），最高OPG值2550；怀孕母猪感染率为50.00%（193/386），最高OPG值为5400；哺乳母猪感染率为43.28%（29/67），最高OPG值为7800；哺乳仔猪感染率为10.71%（9/84），最高OPG值为600；保育猪感染率为10.94%（29/265），最高OPG值为3750。怀孕母猪、哺乳仔猪和保育猪为猪结肠小袋纤毛虫与猪囊等孢球虫的混合感染，其中哺乳仔猪囊等孢球虫感染率最高为50.00%（42/84），感染强度（OPG值）最高达 5500；保育猪感染率为18.87%（50/265），最高OPG值为4200；怀孕母猪感染率为5.44%（21/386），最高OPG值为1650。

3 讨论

目前常用的肠道寄生虫检测计数方法，如McMaster 技术[5]已广泛运用于兽医传染病学中肠道寄生虫的检测，李翔程[6]在四种粪便检查方法，报道中显示McMaster 具有较高的准确性，是一种较为理想的检测方法。目前一种新的检测方法 Mini-Flotac[7]被应用于粪便中寄生虫检测。Barda等[8]评估最近开发的Mini-Flotac方法，并与目前更广泛使用的技术进行比较，以诊断不同环境中的肠道寄生虫感染。Mini-Flotac与McMaster 进行比较发现，麦克马斯特氏计数板的厚度为6.5 mm，但Mini-Flotac最大厚度仅为为5.5 mm，弥补了常规计数板不能再高倍显微镜观察下的缺点；Mini-Flotac检测方法的优点在于时间上更加的高效，操作流程更加的便捷，对虫卵的鉴定也更加的准确，其材质为聚碳酸酯无定形热塑性塑料，不易将其打碎造成不必要的损失。Mini-Flotac检测法在封闭系统中运行，使实验员免受由于操作失误造成的危害。

本研究采用Mini-Flotac对福建龙岩市部分猪场进行粪便漂浮法检查，检测结果显示1029份新鲜粪便样品，其中有457份为阳性样品，总的感染率为44.41%，最低感染强度（OPG值）为150，最高感染强度达7800。检测结果显示，规模化猪场感染率为41.83%（302/722）,中小型猪场感染率为50.49%（155/307）；猪结肠小袋纤毛虫的总感染率为33.43%（344/1029），最高OPG值为7800, 猪囊等孢球虫的总感染率为10.98%（113/1029），表明肠道寄生虫的感染在龙岩地区不存在地区上的差异，与猪场的养殖规模关系不大。这一结论与翁亚彪等[9]对广东集约化猪结肠小袋纤毛虫感染情况调查得出的结论一致。根据不同年龄阶段感染率及结果显示，每个年龄阶段结肠小袋纤毛虫均有感染，感染率大小依次为公猪51.64%＞怀孕母猪50.00%＞哺乳母猪43.28%＞后备母猪20.00%＞保育猪10.94%＞哺乳仔猪10.71%；唐礼德等[10]湖南省规模化猪场结肠小袋纤毛虫感染情况调查，结果显示12个猪场全部都检测到了结肠小袋纤毛虫，李巧燕等[11]对规模化猪场结肠小袋纤毛虫感染情况调查，结果显示结肠小袋纤毛虫感染与猪年龄阶段差异性不明显，示哺乳仔猪猪囊等孢球虫感染率最高为50.00%，感染强度最高

达5500，保育猪感染率为18.87%，怀孕母猪感染率为5.44%。这些数据表明，猪囊等孢球虫主要感染怀孕母猪以及幼龄仔猪。

表2 不同年龄阶段猪肠道寄生虫感染率及感染强度Table 2 intestinal parasite infection rate and infection intensity of pigs at different ages

本次检测结果提示福建龙岩市地区部分猪场猪结肠小袋纤毛虫和猪囊等孢球虫的感染情况。猪结肠小袋纤毛虫发生于各个年龄阶段猪种，粪便一经发现大量滋养体需立刻投药治疗；猪囊等孢球虫主要发生于母猪与哺乳仔猪这一阶段猪种；可采用2.5%妥曲珠利、磺胺类药等药物进行驱虫；同时加强饲养管理，加强猪场圈舍的消毒，及时处理猪产生的粪便，防止投喂的食物接触粪便，做好防鼠措施，容易导致寄生虫的传播和感染[12-14]。此外，本次调查结果表明，猪结肠小袋纤毛虫存在人兽共患风险，同时在饲养过程中应当注意防范，注意个人卫生，防止食源性污染是降低感染的有效途径，切断所有传播媒介以及存在的安全隐患。