氧化苦参碱对非酒精性脂肪性肝病大鼠肝脏保护作用研究*

曾 婷，雷向阳，白晓苏

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)的主要组织学特征为弥漫性肝细胞脂肪变和脂质过量沉积于肝脏部位[1]。学术界普遍认为，NAFLD的发病与肥胖、超重和糖尿病等基础疾病有关。随着饮食结构和生活习惯的改变，NAFLD、肥胖和糖尿病等人群增加[2]。NAFLD可逐步进展为失代偿期肝硬化和肝细胞癌[3]。抗氧化应激和抗脂质沉积可能是应对NAFLD病情发展的思路之一。姜黄素等传统中药在阻断脂质沉积和抑制氧化应激反应方面表现优异[4]。氧化苦参碱(oxymatrine，OMT)是从豆科槐属植物苦参中提取出的有效生物碱，具有较好的清热利湿、利尿解毒活性，可有效抑制乙型肝炎病毒复制，发挥显著的抗肝纤维化和抗肿瘤效应[5]，对肝功能具有较好的保护作用。本实验采用高脂饮食构建NAFLD大鼠模型，观察了OMT干预对肝功能的保护作用，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 实验动物 40只清洁级雄性SD大鼠，6周龄，体质量为200～220 g，购自南方医科大学实验动物中心，保持相对温度为24℃、相对湿度为60%，给予充足的纯净水和常规饲料。

1.2 NAFLD模型的构建 将40只大鼠随机分为对照组10只、模型组10只、OMT处理组10只和辛伐他汀处理组10只。给予普通饲料饲养对照组大鼠，给予其他3组动物高脂饮食饲料(88%普通饲料/10%猪油/2%胆固醇)喂养16 w，并从第9 w开始分别给予生理盐水、OMT(苏州医药有限公司，国药准字H20100410)60 mg·kg-1、辛伐他汀(广州南新制药有限公司，国药准字H20010748)60 mg·kg-1灌胃处理。在16 w末，所有大鼠禁食12 h，称体质量，给予10%水合氯醛麻醉后经腹主动脉取血，取出肝组织后称质量。用眼科剪将肝组织剪碎成约5 mm3大小的组织块，用无菌生理盐水冲洗，将组织块分为2份，其中一份以4%多聚甲醛固定，脱水透明，石蜡包埋、切片，HE染色或伊红染色，在南京伊若达仪器设备有限公司提供的Olympus CX43显微镜下观察；另一份肝组织则保存于-80℃冰箱冻存。

1.3 血清检测 使用深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司提供的BS-280全自动生化分析仪检测血生化指标；采用ELISA法[6]检测血清白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-6、IL-10和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平(上海研生实业有限公司)。

1.4 肝组织氧化应激指标检测 取肝组织，加入组织裂解液进行匀浆，4℃下高速离心后取上清液，采用BCA法测定蛋白浓度。取20 μg总蛋白加等体积液体稀释。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)水平检测：将待测样品加入96孔板，设置对照孔，室温下孵育20 min，使用上海闪谱生物科技有限公司提供的SuPerMax 3000FA型多功能酶标仪检测560 nm处的吸光度(OD)值；还原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)水平检测：将待测样品加入96孔板、摇匀，加入工作液150 μl，25℃下孵育5 min，再加入还原型辅酶Ⅱ 50 μl，共同培养25 min，在酶标仪检测412 nm处的OD值；丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平检测：以组织裂解液作为对照，加样品于离心管，依次加入标准品0.1 ml、待测样品0.1 ml和工作液0.2 ml，充分摇匀，100℃下孵育15 min，冷却后高速离心10 min，取上清液置于96孔板，在酶标仪检测532 nm处OD值。

2 结果

2.1 各组大鼠肝组织形态学变化 对照组大鼠肝组织形态完整，细胞排列整齐，无空泡及脂质沉积；模型组大鼠肝组织形态不规正，细胞排列无序，空泡和脂质沉积明显；与模型组比，OMT和辛伐他汀处理组肝组织形态较为完整，细胞排列较整齐，细胞内空泡和脂质沉积明显减少，炎性病变明显改善(图1)。

图1 各组大鼠肝组织形态学变化(HE，200×)

2.2 各组大鼠体质量和肝质量比较 在实验结束时，OMT和辛伐他汀处理组大鼠体质量和肝质量均显著低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05，表1)。

表1 各组大鼠体质量和肝质量比较

2.3 各组大鼠肝功能指标比较 OMT和辛伐他汀处理组大鼠血清ALT和AST水平均显著低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05，表2)。

表2 各组大鼠肝功能指标比较

2.4 各组大鼠血脂指标比较 OMT和辛伐他汀处理组大鼠血清TC、TG和LDL水平均显著低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05，表3)。

表3 各组大鼠血脂指标比较

2.5 各组血清细胞因子水平比较 OMT和辛伐他汀处理组大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平均显著低于模型组，而血清IL-10水平显著高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05，表4)。

表4 各组大鼠血清细胞因子水平比较

2.6 各组大鼠肝组织氧化应激指标比较 OMT和辛伐他汀处理组大鼠肝组织SOD和GSH水平显著高于模型组，而MDA水平显著低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05，表5)。

表5 各组大鼠肝组织氧化应激指标比较

3 讨论

NAFLD是以肝细胞胞浆中脂肪过度积累为典型特征的临床高发疾病，其发病机制较为复杂。目前普遍认为，肝脂肪病变、胰岛素抵抗、炎症刺激和氧化应激反应的过度激活均会导致NAFLD的发病[7]。传统中医则认为，痰、湿、热、毒、疲是NAFLD发病的主要病因，应从活血化瘀、疏肝祛湿为本病的治则[8]。苦参是具有清热凉血、养肝祛湿功效的中药，氧化苦参碱是其主要活性成分，具有较好的抗炎、抗氧化作用[9]。本实验采用OMT干预NAFLD大鼠，观察大鼠体质量、肝质量、肝功能和血脂水平的变化，希望为应用OMT干预NAFLD提供实验依据。

经高脂饲料喂养建立大鼠NAFLD模型是当前主流的建模方法，对于实验用药具有较好的指导作用[10]。本研究采用高脂饮食饲料喂养SD大鼠以构建NAFLD大鼠模型，再以氧化苦参碱灌胃干预，结果显示，经OMT处理后，模型大鼠肝脂肪变性和细胞内空泡显著改善，肝脏内炎性反应明显减轻，并有效减轻大鼠体质量和肝质量。脂质沉积和肝脏脂肪变性是NAFLD大鼠的典型特征[11]。氧化苦参碱通过减轻模型大鼠体质量，改善因肥胖导致的脂肪病变和脂质过量囤积，抑制脂质过氧化反应和炎性反应，避免在持续炎性环境和过氧化环境中由单一脂肪变性进展为NAFLD[12]，减轻模型大鼠肝损伤程度。

本研究结果显示，与模型大鼠相比，经氧化苦参碱灌胃处理的OMT组大鼠血清ALT和AST水平均显著低于模型组，血TC、TG和LDL等水平也较模型组降低，表明氧化苦参碱可有效降低NAFLD大鼠血脂水平，改善大鼠肝功能[13，14]。当机体存在大量脂质堆积时血清TC、TG和LDL水平显著升高[15]。氧化苦参碱具有祛湿化痰、活血养肝的功效，通过促进模型大鼠肝脏内血液循环，阻止过量脂肪堆积于肝脏部位[16]，抑制脂质沉积，从而降低大鼠血脂水平，改善肝功能，发挥显著的肝脏保护作用。

在本研究，与模型组相比，OMT处理组大鼠肝组织匀浆促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平显著降低，而抗炎因子IL-10水平显著升高，表明OMT可显著抑制NAFLD发病过程中的炎症反应。此外，经OMT处理后的大鼠肝组织内抗氧化能力指标SOD和GSH水平显著升高，脂质过氧化活性产物MDA水平显著降低，表明氧化苦参碱可抑制模型大鼠体内氧化应激反应。本研究结果提示，氧化苦参碱具有肝脏保护作用，可能是通过抗炎和抗氧化应激反应实现的，氧化苦参碱可抑制脂质大量积累和脂质过氧化过程[17]，避免过量的过氧化产物进入肝脏和血液引起的中性粒细胞激活，从而抑制炎症反应[18]，防止多余的炎性细胞因子合成、分泌和释放导致的肝脏损伤[19]，不仅抑制了应激反应，还阻止了炎症反应的激活，从源头上抑制两种反应互相促进、恶性循环造成的肝脏损伤[20]，有效降低肝组织氧化应激相关指标水平。