微小RNA-21、592在成釉细胞瘤中的表达及临床意义

马 佳，赵 琳，黄永清

(1.宁夏医科大学口腔医学院，宁夏 银川 750004；2.中卫市人民医院口腔科，宁夏 中卫 755099)

成釉细胞瘤(AB)为最常见的牙源性上皮肿瘤，目前临床外科手术为AB唯一的治疗手段，手术可导致患者牙列缺损、丧失或病理性骨折，对患者身心造成极大的伤害及负担[1]。因此，阐述该肿瘤的发病机制寻找早期的诊断方式具有一定的临床意义。微小RNA(miR)-592过表达在体外显著抑制乳腺癌细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭，并在体内抑制肿瘤生长[2]；miR-21可通过参与调控基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达，促进胰腺癌的侵袭和转移[3-4]。miR-21、miR-592在AB中的研究还不明确，本研究试图探讨AB患者石蜡组织中的表达差异，分析它们在AB中的表达情况，为进一步寻找AB的分子标志物奠定基础。

1 资料与方法

1.1一般资料：收集2015年6月～2020年1月就诊于宁夏医科大学附属总医院口腔颌面外科AB的患者，术中术后病理诊断为AB，光学显微镜下标记AB组与自身瘤旁组织(对照组)各20例。患者均经过影像学、病理学及其他各项检查确诊，排除其他肿瘤病史、遗传病史，排除患者接受过放疗、化疗，排除无法满足提供肿瘤及瘤旁组织的样本且miRNA浓度<200 μg/ml。所有患者均有完整的临床资料和病理资料，本研究经过本院医学伦理委员会同意。

1.2方法

1.2.1主要试剂:石蜡包埋组织切片miRNA提取试剂盒购自天根生化有限公司，PrimeScriptTMRT试剂购自Takara，QuantiNova SYBR Green PCR Kit购自Qiagene,miR-21、miR-592、U6引物购自生工生物有限公司。

1.2.2引物序列:利用miRNA序列数据库找到人类miR-21、miR-592序列，由生工合成反转录引物和PCR上下游引物。miR-21茎环反转录引物5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAACA-3′，上游引物5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′,下游引物5′-GCGCGTAGCTTATCAGACTGA-3′；miR-592茎环反转录引物5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGA CACATCA-3′，上游引物5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′,下游引物5′-CGCGTTGTGTCAATATGCGA-3′；U6茎环反转录引物5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACT GGATACGACAAAATA-3′，上游引物5′-ATCCAGTGCAGG GTCCGAGG-3′,下游引物5′-AGAGAAGATTAGCATGGCCC CTG-3′。

1.2.3逆转录CDNA(complementary DNA，互补DNA)链的合成:根据FFPE(Formalin-Fixed and Parrffin-Embedded，甲醛溶液固定后的石蜡组织)提取miRNA试剂盒DP502说明书提取miRNA。分光光度仪测量RNA浓度和质量，-80℃保存；按照 TAKARA 说明书配制逆转录反应体系, 以500 μmol/L计算加入RNA的体积，配置茎环原液，总体系为10 μl,全程置于冰上。 42℃ 15 min、85℃ 5 min、4℃ 1 min合成 cDNA,-20℃保存。

1.2.4荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测:2×QuantiNova SYBR PCR混合液10 μl、QN ROX参考染色剂0.1 μl、引物A、B各1.4 μl、cDNA 2.0 μl、无酶水5.1 μl,反应体系为20 μl。反应条件为95℃ 5 min预变性，95℃ 5 s、60℃ 31 s，40个循环后采集荧光信号，熔解曲线由仪器自动设置。

2 结果

2.1AB组与对照组miR-21表达水平比较:AB组与对照组中miR-21平均表达量值分别为：19.50±0.48，21.78±0.17，以对照组miR-21相对表达量为1，AB组miR-21表达水平是对照组的23.72倍，且基因表达上调差异具有统计学意义(P<0.01)。见图1。

注：与对照组比较，①P<0.01图1 miR-21在AB组与对照组的表达

2.2AB组与对照组miR-592表达水平比较:AB组与对照组中miR-592平均表达量值分别为：24.27±0.38，29.86±0.86，以对照组miR-592相对表达量为1，AB组miR-592基因表达水平是对照组的2.58倍，且基因表达上调差异具有统计学意义(P<0.05)。见图2。

注：与对照组比较,①P<0.01图2 miR-592在AB组与对照组的表达

2.3AB组miR-21、miR-592在不同年龄、性别分组间表达水平比较：miR-21、miR-592与AB组0～30岁、31～60岁、>60岁、男女分组表达水平差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 AB组不同年龄、性别患者与miR-21、miR-592表达量的比较

2.4miR-21、miR-592及内参U6表达：miR-21、592及U6的qRT-PCR显示其扩增曲线呈现S型，有明确的基线期、平台期、指数期；qRT-PCR熔解曲线均为单峰；说明实验扩增的目的基因特异性强。见图3～4。

图3 miR-21及U6 qRT-PCR熔解曲线及扩增曲线

图4 miR-592及U6 qRT-PCR熔解曲线及扩增曲线

3 讨论

AB多发生于青壮年，以下颌体及下颌角为常见，可使颌骨膨大，吸收颌骨外侧骨板，因具有侵袭性AB被视为“临界瘤”。miRNA参与生命体的增殖、分化、生长及凋亡等多种过程，发挥着类似癌基因和抑癌基因的功能[5]。

miR-21在多种肿瘤中被证实表达上调，且为PTEN的靶基因[6-7]，在骨肉瘤中，PTEN与MMP-2呈负相关[8]；转化生长因子-β(TGF-β)是miR-592的直接靶基因。目前研究表明在AB中TGF-β1与MMP-2呈正相关，且可以通过上调MMP-2从而促进AB的发生、发展[9]。qRT-PCR检测发现AB中MMP-2的miRNA显著高于正常牙囊组织，复发性AB的MMP-2与膜1型金属蛋白酶(MT1-MMP)mRNA(信使RNA)显著高于原发性AB，MMP在AB中被证实与AB的高度局部侵袭性有密切关系。在本研究中，实验结果显示miR-21、miR-592在AB组与对照组之间差异具有统计学意义(P<0.05)，其表达水平显著上调，这与miR-21、miR-592在其他肿瘤中表达水平研究结果一致，推测miR-21、miR-592的表达上调可能与AB的侵袭性有关，而患者一般情况分组间没有差异。

本研究中采用了从FFPE提取miRNA，一般情况下FFPE中miRNA是可稳定存在，有学者将匹配好7对的FFPE和新鲜冰冻组织进行 miRNA浓度检测，相关指数为0.847～0.948[10]；FFPE的优点：提取的miRNA与冰冻组织样本相同，可提供可信的表达谱[11-12]。本研究中，FFPE组织提取的miR-21、miR-592显示出正常的熔解曲线和扩增曲线，也证明了FFPE组织中提供的miRNA表达谱可信。