响应面法优化二氢杨梅素口服纳米粒的制备工艺研究*

2022-09-23陆建媚黄理清麦琬婷覃裕翠苏晓丹张传政钟华帅曾勇珠黄秋洁

广西医科大学学报 2022年8期

陆建媚，黄理清，麦琬婷，覃裕翠，苏晓丹，张传政，钟华帅，曾勇珠，黄秋洁，叶勇,3△

（1.广西医科大学药学院，南宁 530021；2.广西中医药大学药学院，南宁 530001；3.广西生物活性分子研究与评价重点实验室，南宁 530321）

口服纳米制剂是现代生物医学技术领域的研究热点之一[1]。与传统的药物释放方法相比，纳米载体可以保护药物不受环境污染[2]。研究发现，二氢杨梅素（DMY）在抗肿瘤方面效果明显而且具备潜力开发为肝癌辅助用药[3]。口服纳米载药系统给药可以保护药物不受胃肠道生理环境所破坏，同时纳米粒（NPs）还能够快速穿透消化道的黏液层，促进肠上皮细胞的内吞，有利于克服口服吸收的多重屏障[4]。因此，为提高DMY 抗肝癌活性、提高其在胃肠道中的稳定性和进一步提高生物利用度，研究DMY口服缓释的纳米给药制剂。

近年来壳聚糖（CS）[5-8]和果胶（PEC）[9-10]作为一种天然安全的载体材料在口服NPs的研究中越来越受到关注。在本研究中，以DMY为模型药物，通过CS 质子化的-NH3+与PEC 质子化的-COO-，用三聚磷酸钠（STPP）为离子交换剂，发生离子交联，形成聚电解质复合物。该复合物可以抵抗胃液及小肠中蛋白酶的水解作用，负载载体的DMY 到达肠道后释放且黏附于结肠黏膜表面。使药物在结肠转运和停留的时间较长，减少了DMY 过早释放药效和临床疗效差的问题；提高了DMY的稳定性，进而提高DMY的生物利用度。

1 仪器与材料

1.1 仪器 1260 Infinity 高效液相色谱仪（安捷伦）；Nano ZSMPT-2 纳米粒度电位仪（英国Malvern公司）；JY92-IIDN 超声波细胞粉碎机（900 W，宁波新芝生物科技股份有限公司）；B13-3型智能恒温定时磁力搅拌器（上海司乐仪器有限公司）；DZF-300真空干燥箱（郑州长城科工贸有限公司）；pH 计、十万分之一电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；低速台式离心机（上海菲恰尔分析仪器有限公司）。

1.2 材料 DMY 对照品（成都瑞芬思生物科技有限公司，批号：Q-006-181218），DMY（长沙上禾生物科技有限公司）；CS（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：L2004257）；PEC（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：SLCG1374）；氢氧化钠（成都市新都区木兰镇工业开发区，批号：20120202）；无水乙醇（成都市科隆化学品有限公司，批号：2021091002）；乙腈（赛默飞世尔科技有限公司，批号：206482）；甲醇（赛默飞世尔科技有限公司，批号：204135）；磷酸（重庆川东化工集团有限公司，批号：2021110801）；三乙胺（天津市大茂化学试剂厂，批号：20210217）；冰乙酸（成都市科隆化学品有限公司，批号：2017041301）；盐酸（廉江市爱廉化试剂有限公司，批号：2020092201）。

2 方法

2.1 色谱条件 Kromasil C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流动相∶乙腈—0.2%磷酸三乙胺（22∶78）；流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃；检测波长：291 nm；进样量：20 μL。

2.2 溶液制备（1）对照品溶液的制备：精密称取1 mg DMY 对照品，置于5 mL 量瓶中，甲醇溶解并定容，得质量浓度为200 μg/mL 对照品溶液。（2）供试品CS-DMY-PEC-NPs的制备：精密量取CS-DMYPEC-NPs溶液1～5 mL，甲醇定容至刻度线，得供试品溶液。（3）阴性对照品CS-PEC-NPs的制备：取CSPEC-NPs 按供试品溶液配制方法制备阴性对照溶液。

2.3 专属性考察分别将DMY 对照品溶液、CSDMY-PEC-NPs 溶液和CS-PEC-NPs 阴性对照溶液按“2.1 项”下方法进样测定，记录进样色谱图，结果表明，DMY 在供试品溶液和对照品溶液中出峰位置一致，样品中其他成分对DMY含量测定无干扰，见图1。

图1 HPLC色谱图

2.4 线性关系考察精密称取DMY 1.00 mg，置于5 mL 容量瓶中，加入适量的甲醇溶解并定容，得200 μg/mL 的对照品母液，从母液中精密吸取适量的对照品溶液分别配置成1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL、8 μg/mL、16 μg/mL 系列质量浓度的溶液。在“2.1 项”色谱条件下进样，该色谱条件下，出峰时间约为6.5 min，以峰面积为纵坐标（Y），浓度为横坐标（X）进行线性回归，得回归方程为Y=43.808X-14.681（r=0.999 6），表明DMY在1～16 μg/mL线性关系良好。

2.5 精密度考察低、中、高（2 μg/mL、6 μg/mL、12 μg/mL）3个浓度的DMY原料药溶液，在“2.1项”色谱条件下进样分析，每一浓度进样6次，记录峰面积，测得日内精密度（RSD）分别为1.04%、0.75%和1.44%；日间RSD分别为1.08%、0.99%、0.59%（n=6，连续6 d）。

2.6 重复性考察按照“2.1 项”方法平行制备6 份样品溶液，进样记录峰面积，计算得CS-DMY-PECNPs的峰面积RSD值为2.38%，所以重复性良好。

2.7 NPs 的制备（1）CS-PEC-NPs 的制备：采用离子凝胶法制备，将PEC 和STPP 用纯水配制，用2%的醋酸配制CS并调至一定pH。随后在磁力搅拌锅中按照1 mL/min的速度匀速将STPP溶液和PEC溶液依次加入CS 溶液中，滴加完毕后搅拌30 min，通过离心收集NPs，实验重复3 次。（2）CS-DMY-PECNPs 的制备：载体溶液配制同上，称取适量DMY 溶解于无水乙醇中，在磁力搅拌锅中按照1 mL/min的速度匀速将STPP溶液、DMY溶液和PEC依次加入CS 溶液中，滴加完毕后搅拌30 min，通过离心收集NPs，实验重复3次。

2.8 CS-DMY-PEC-NPs包封率、载药量的测定

采用低速离心法测定CS-DMY-PEC-NPs 的包封率和载药量。将“2.7 项”制备的样品，在4 000 r/min离心20 min，取上清液，HLPC检测，计算游离浓度，结果为未被包封DMY质量，离心后沉淀物真空干燥后的重量为载药系统总质量。包封率=（DMY质量-未被包封DMY 质量）/DMY 总质量×100%，载药量=（DMY 质量-未被包封DMY 质量）/载药系统总质量×100%。

2.9 CS-DMY-PEC-NPs 粒径、聚合物分散性指数（PDI）和电位的测定取“2.8 项”下离心后沉淀物真空烘干的样品，在酸性条件下重新分散后稀释至一定倍数，过膜后测定其粒径、PDI和电位。

2.10 单因素分析在预实验的基础上，分别对CSDMY-PEC-NPs 的制备过程中影响包封率的6 个主要影响因素：不同的质量比（CS∶STPP∶DMY∶PEC）、PEC浓度、CS的pH值、CS浓度、TPP浓度、离心转速等进行逐一考察。

2.11 质量比考察固定PEC、STPP、DMY 浓度为1 mg/mL，分别考察CS∶STPP∶DMY∶PEC 的质量比（2.1∶1∶1∶1、2.8∶1∶1∶1、3.5∶1∶1∶1、4.2∶1∶1∶1）对CS-DMY-PEC-NPs包封率、载药量和粒径的影响。

2.12 PEC 浓度考察固定CS∶STPP∶DMY∶PEC的质量比为2.8∶1∶1∶1，STPP、DMY 浓度1.0 mg/mL，CS 浓度1.4 mg/mL，分别考察PEC 浓度1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、3.0 mg/mL 和4.0 mg/mL 对CSDMY-PEC-NPs包封率、载药量和粒径的影响。

2.13 CS的pH值考察固定CS∶STPP∶DMY∶PEC的质量比为2.8∶1∶1∶1，STPP、DMY 浓度1.0 mg/mL，CS 浓度1.4 mg/mL，分别考察CS 溶液的pH 值3.5、4.0、4.5 和5.0 对CS-DMY-PEC-NPs 包封率、载药量和粒径的影响。

2.14 CS 浓度考察固定CS∶STPP∶DMY∶PEC 的质量比为2.8∶1∶1∶1，PEC、STPP 和DMY 浓度1.0 mg/mL，分别考察CS 浓度0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、1.5 mg/mL 和2.0 mg/mL 对CS-DMY-PEC-NPs包封率、载药量和粒径的影响。

2.15 STPP 浓度考察固定CS∶STPP∶DMY∶PEC的质量比为2.8∶1∶1∶1，PEC、DMY浓度1.0 mg/mL，CS 浓度1.4 mg/mL，分别考察STPP 浓度0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL 和1.5 mg/mL 对CSDMY-PEC-NPs包封率、载药量和粒径的影响。

2.16 离心转速考察固定CS∶STPP∶DMY∶PEC的质量比为2.8∶1∶1∶1，PEC、STPP、DMY 浓度1.0 mg/mL，CS 浓度1.4 mg/mL，分别考察离心转速1 000 r/min、2 000 r/min、3 000 r/min 和4 000 r/min对CS-DMY-PEC-NPs包封率、载药量和粒径的影响。2.17 最优处方实验设计根据响应面法，结合前期处方筛查单因素考察结果，选取对NPs 性质影响最大的3个因素进行响应面考察，获取最优处方。

3 结果

3.1 质量比的考察结果结合粒径、包封率和载药量分析，CS∶STPP∶DMY∶PEC 的质量比2.8∶1∶1∶1是最佳条件，见表1。

表1 CS∶STPP∶DMY∶PEC的质量比对CS-DMY-PEC-NPs各指标的影响，n=3

3.2 PEC浓度的考察结果结合粒径、包封率和载药量分析，PEC浓度1.0 mg/mL是最佳条件，见表2。

表2 PEC浓度对CS-DMY-PEC-NPs各指标的影响，n=3

3.3 CS的pH值的考察结果结合粒径、包封率和载药量分析，pH值4.5是最佳条件，见表3。

表3 CS的pH值对CS-DMY-PEC-NPs各指标的影响，n=3

3.4 CS 浓度的考察结果结合粒径、包封率和载药量分析，CS浓度1.0 mg/mL是最佳条件，见表4。

表4 CS浓度对CS-DMY-PEC-NPs各指标的影响，n=3

3.5 STPP 浓度的考察结果结合粒径、包封率和载药量分析，STPP 浓度1.0 mg/mL 时是最佳条件，见表5。

表5 STPP浓度对CS-DMY-PEC-NPs各指标的影响，n=3

3.6 离心转速的考察结果结合粒径、包封率和载药量分析，离心转速2 000 r/min是最佳条件，见表6。

表6 离心转速对CS-DMY-PEC-NPs各指标的影响，n=3

3.7 响应面法得出最优处方采用响应面法，以PEC 浓度（X1）、CS 的pH 值（X2）、离心转速（X3）为考察因素，在单因素考察的基础上，确定取值范围，PEC 浓度2.0～4.0 mg/mL，CS 的pH 值3.5～4.0，离心转速2 000～4 000 r/min。以包封率（Y1）、载药量（Y2）、粒径（Y3）为指标，按照“2.7项”下方法制备CSDMY-PEC-NPs，获取最适宜的纳米给药系统。因素水平见表7，实验设计见表8。

表7 响应面法试验因子水平

本试验有3个函数指标，所以将包封率、载药量和粒径归一化处理得出总评归一值（OD）值，并以OD 值为CS-DMY-PEC-NPs 的响应指标。从图2 中可以看出OD值三维响应面均为曲面。说明PEC浓度、CS的pH值、离心转速三者用量与OD值之间为非线性关系。计算过程：（1）包封率（d1）和载药量（d2）越大越好，dmax=（Mi-Mmin）/（Mmax-Mmin）；粒径（d3）越小越好，dmax=（Mmax-Mi）/（Mmax-Mmin）（Mi 表示测量值，Mmin 表示最小值，Mmax表示最大值）。（2）各指标归一值算几何平均数，得总评归一OD 值，计算公式为（k 为指标数），见表8。

表8 CS-DMY-PEC-NPs的实验设计因素及结果

图2 CS-DMY-PEC-NPs处方优化中各因素交互作用的响应面图

采用Design-Expert 8.0.6.1 软件，以OD 值为因变量对各因素进行二项式拟合分析，拟合方程为：OD=0.53-0.005X1+0.074X2+0.33X3-0.17X1X2-0.022X1X3-0.075X2X3-0.094X12-0.066X22-0.046X32（R2=0.837 6，Radj2=0.628 7，P=0.040 3），二项式方程拟合时用相关系数R2表示，由拟合方程式得知此模型的拟合度较高，能很好地反映3 个考察因素与评价指标之间的关系。模型的确定系数为Radj2值，OD值Radj2值为0.628 7，表明响应值的变化有62.87%来源于3 个自变量的影响，方程的因变量与全体自变量间具有显著的线性关系。

对于响应指标OD值进行方差结果分析，从表9方差分析的显著性检验可知，模型P小于0.05 说明模型显著，表明单独或相互作用项之间没有显著差异。拟失项大于0.05，说明未知因素对模型干扰很小。

表9 OD值方差分析结果

3.8 工艺验证平行制备并测定3 份CS-DMYPEC-NPs最优处方的包封率、载药量、粒径，并与预测值相比较，计算实际值与预测值的偏差，偏差=（预测值-实测值）/预测值×100%，见表10，实测值与预测值在误差范围内。实测包封率、载药量和粒径大小与预测值较为接近，证明应用响应面优化CSDMY-PEC-NPs 处方具有良好的预测性，可靠性较高。CS-DMY-PEC-NPs粒径分布图见图3。

图3 CS-DMY-PEC-NPs粒径图

表10 预测值与实测值的比较

4 讨论

离子凝胶法通过STPP 上带负电荷PO-Na-与CS上带正电荷质子化的-NH3+发生分子间和分子内交联而形成NPs[11]，该法操作简单、作用时间短、工艺条件易得且所用试剂无毒[12]，所以用该法研究制备的CS-DMY-PEC-NPs 没有毒副作用。本实验应用该法可在室温条件下制备出粒径大小均一、稳定的NPs。

响应面法可以建立二次多项式方程，利用多项式近似把因子与研究结果关系函数化，既可以保证实验准确度，还可以研究多种因素相互影响。从而获取了多个因素的最佳组合和整个区域的最佳响应值[13]。响应面法可以同时对实验的各个水平因素进行分析，具有良好的预测性。研究证明，采用响应面法进行处方优化，得到的预测值与理论值较接近，说明建立的模型预测性较好。本实验在单因素的基础上，通过响应面法对CS-DMY-PEC-NPs处方进行优化，对结果进行二项式拟合分析以及二维、三维效应面，并在最优区域筛选出最佳处方范围值，得到最佳的制备工艺。

CS 是一种阳离子聚合物。由于其具有生物降解性、生物相容性、生物靶向性、生物粘附特性和渗透性增强等特性，已成为纳米药物载体的研究热点[14]。PEC 是一种阴离子可溶性多糖，从植物的初生细胞壁中提取。PEC可以完整地通过上消化道，并被肠道菌群分解。PEC 在结肠的碱性pH 值下是一种粘稠的粘合剂[10]。然而，单独使用时，PEC在碱性条件下会膨胀，这可能导致药物负荷过早释放。当与其他聚合物结合使用时，会产生更稳定的基质。因此，使用PEC 和CS 作为载体，以限制DMY在较高pH 值下的过早释放，确保在肠道条件下改善黏液黏附性。此外，PEC 容易被结肠微生物降解，这将确保DMY 从复合聚合物基质中局部释放。所以在本研究中用传统的CS作为纳米药物载体以及STPP作为交换剂制备NPs外，还增加了PEC作为纳米药物载体。为后续用CS-PEC作为载体包载药物达到靶向肠道菌群奠定实验基础。

在后续研究中，还对CS-DMY-PEC-NPs的质量表征及体内外的药效、药动及安全性进行深入研究，为其新剂型的开发与应用奠定基础。