血清外泌体miR-22-3p与类风湿性关节炎病情严重程度的关系研究*

庞琳烜，杨西超，李治琴，杜望磊

（空军军医大学第一附属医院临床免疫科，西安 710032）

类风湿性关节炎是一种常见病，致残率较高[1]，其早期诊断主要依靠临床表现、影像学检查及实验室检查。该病临床表现多样，检查指标的灵敏度较低，限制了对该病的早期诊断，延误了最佳治疗时间，不利于患者预后[1]。外泌体是直径为40～100 nm的盘状囊泡，来源于细胞溶酶体微粒内陷形成的囊泡，被释放到细胞外基质中，内含蛋白质、脂质、微小RNA（microRNA，miRNA）、环状RNA等，可参与多种生物学过程[2]。其中miRNA 是一类长度为20～24 个核苷酸的小RNA，在外泌体中稳定存在，可随着外泌体循环被远处或邻近细胞所摄取，参与多种病理生理过程[3]。研究发现，在类风湿性关节炎患者的外周血中有多种miRNA 呈异常表达，miRNA 对心血管疾病、肾脏疾病、肿瘤等有一定的临床诊断价值[4-5]。miR-22-3p是近年来新发现的一种miRNA，在类风湿性关节炎中的表达及意义鲜少报道。有研究发现，类风湿性关节炎患者血浆及外周血单个核细胞中miR-22-3p表达水平升高[6-7]。本研究从类风湿性关节炎患者外周血中提取外泌体，探讨血清外泌体miR-22-3p与类风湿性关节炎病情严重程度的关系及其早期诊断价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2020 年12 月至2021 年12 月空军军医大学第一附属医院收治的类风湿性关节炎患者100例（类风湿性关节炎组），其中处于活动期64 例，缓解期36 例；男39 例，女61 例；年龄38～71 岁，平均（53.19±3.08）岁；体重指数（21.12±2.01）kg/m2。病例纳入标准：（1）符合类风湿性关节炎的诊断标准[8]；（2）年龄≥18 岁；（3）临床资料完整。排除标准：（1）急慢性感染性疾病；（2）肿瘤；（3）免疫缺陷；（4）代谢性疾病。另选取同期在本院行体格检查的健康志愿者100例为对照组，其中男42例，女58例；年龄35～68 岁，平均（52.09±4.11）岁；体重指数（21.56±2.33）kg/m2。两组性别、年龄等一般资料比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 血清外泌体的分离和鉴定 采集患者晨起空腹肘静脉血1 mL，2 000 r/min 离心15 min，留取血清，于-80 ℃冰箱保存备用。用外泌体提取试剂盒（西安齐岳生物科技有限公司）提取血清外泌体。取10 μL外泌体加于铜网上，沉淀1 min。加入10 μL 2%醋酸双氧铀于铜网上沉淀1 min。常温下干燥15 min，随后用JEM-2100F 透射电子显微镜（上海研酷检测中心）观察。

用Western blotting 法检测外泌体标志物TSG101 和CD63 的蛋白表达[9]。用RAPI裂解液提取总蛋白，BCA 试剂盒检测蛋白浓度；10% SDSPAGE 电泳分离蛋白，用半干转移法将蛋白转至PVDF 膜；5%脱脂奶粉封闭2 h，加入一抗TSG101（1∶10 000，美国Sigma 公司）、CD63（1∶200，美国Sigma 公司）4 ℃冰箱孵育过夜，用TBST 缓冲液洗膜3 次后加入二抗，室温下孵育2 h，ECL 发光仪进行蛋白成像。

1.2.2 红细胞沉降率（ESR）和C反应蛋白（CRP）检测 用免疫酶化学发光仪（法国梅里埃公司）检测ESR 和CRP，ESR 的检测用魏氏法，CRP 的检测用免疫比浊法。

1.2.3 实时荧光定量PCR 法检测外泌体miR-22-3p表达水平 用Trizol 法提取总RNA，反转录为cDNA，用荧光定量试剂盒（西安齐岳生物科技有限公司）进行PCR 扩增，用2-△△CT法计算miR-22-3p相对表达量。引物序列：miR-22-3p上游5’-GGCGATCATACTGGGAGATG-3’，下游5’-TGTGATTCAAGTTGGGGTCA-3’；内参U6上游5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’，下游5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’。

1.2.4 类风湿性关节炎Steinbrocker 影像学分级及病情活动度评分 根据手与腕部X 线检查，进行Steinbrocker分级[10]：（1）I级：正常或者可能存在骨质疏松；（2）Ⅱ级：骨质疏松伴有软骨下骨质破坏，轻度关节间隙狭窄；（3）Ⅲ级：明显关节面下骨质破坏、关节变形、关节间隙狭窄，但无纤维性或者骨性强直；（4）Ⅳ级：除Ⅱ级、Ⅲ级表现外，伴有纤维性或者骨性强直。类风湿性关节炎活动度评价表（DAS28）[11]：疾病缓解为＜2.6 分；低活动度为2.6～3.2分；中度活动度为＞3.2分且≤5.1分；高活动度为＞5.1分。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0 统计软件处理数据。计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t检验；两组独立样本间比较用独立样本t检验。相关性分析用Pearson检验。用受试者工作特征曲线（ROC）分析血清外泌体miR-22-3p 诊断类风湿性关节炎的价值，计算曲线下面积（AUC）、灵敏度和特异度。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清外泌体的鉴定

显微镜下可观察到外泌体呈囊泡状，直径约为40～100 nm（图1 白色箭头所示）。Western blotting实验可检测到外泌体标志物TSG101及CD63（图2）。

图1 透射电子显微镜观察外泌体（×50 000）

图2 Western blotting法检测外泌体标志物TSG101及CD63

2.2 两组血清外泌体miR-22-3p表达水平比较

类风湿性关节炎组血清外泌体miR-22-3p相对表达量为（1.78±0.34），高于对照组的（0.72±0.21）（P＜0.05）。ROC 曲线显示：血清外泌体miR-22-3p诊断类风湿性关节炎的AUC为0.82，诊断最佳临界值为1.54，灵敏度和特异度分别为82.39%和74.15%，见图3。

图3 血清外泌体miR-22-3p诊断类风湿性关节炎的ROC曲线

2.3 类风湿性关节炎患者血清外泌体miR-22-3p表达水平与Steinbrocker分级、病情活动度的关系

Steinbrocker Ⅳ级患者血清外泌体miR-22-3p表达量为（2.03±0.71，n=32）、Ⅲ级为（1.79±0.45，n=40）、Ⅱ级为（1.53±0.23，n=28），分级越高，表达水平越高（F=19.347，P＜0.001）。活动期患者血清外泌体miR-22-3p表达量为（2.10±0.45，n=64），高于缓解期患者的（1.45±0.30，n=39）（P＜0.05）。重度活动度患者血清外泌体miR-22-3p表达量为（2.40±0.76，n=26），中度活动度为（2.00±0.38，n=20），轻度活动度为（1.89±0.21，n=18），活动度越高，表达水平越高（F=8.564，P=0.002）。

2.4 类风湿性关节炎患者血清外泌体miR-22-3p表达水平与ESR、CRP的关系

血清外泌体miR-22-3p 分别与ESR、CRP 呈正相关关系（r=0.307，r=0.370，P＜0.05），见图4。

图4 类风湿性关节炎患者血清外泌体miR-22-3p表达水平与ESR、CRP的相关性分析

3 讨论

miR-22-3p在肾脏损伤[12]、高血压[13]、心肌梗死[14]和癌症[15]等多种疾病中有异常表达。本研究发现，类风湿性关节炎组血清外泌体中miR-22-3p 表达水平明显高于对照组，与既往研究结果相一致[7]；ROC 曲线分析显示，血清外泌体miR-22-3p 对类风湿性关节炎有一定的诊断价值。本研究结果提示miR-22-3p表达上调可能促进类风湿性关节炎的发生和发展，可能与miR-22-3p 介导免疫炎症损伤有关[16]。

ESR、CRP 与类风湿性关节炎病情活动度有关[17]。本研究中，活动期患者血清外泌体miR-22-3p表达量高于缓解期患者。患者活动度越高，血清外泌体miR-22-3p 表达水平越高。另外，血清外泌体中miR-22-3p表达水平与ESR、CRP表达水平有关，表明外泌体中miR-22-3p可以作为评估类风湿性关节炎病情活动性的参考指标。本研究采用Steinbrocker 影像学分级对类风湿性关节炎病情进行评价，结果显示，Steinbrocker分级越高，患者血清外泌体miR-22-3p表达水平越高。说明血清外泌体miR-22-3p可评估关节破坏的进展。以上结果说明血清外泌体miR-22-3p可能作为监测类风湿性关节炎活动性、判断影像学进展的指标。

本研究也存在一些局限性：（1）本研究检测了类风湿性关节炎患者血清外泌体miR-22-3p表达水平及临床意义，但是未分析其作用机制，未来需要开展细胞及动物研究进行探讨；（2）未对患者进行随访，外泌体miR-22-3p 与类风湿性关节炎病情动态变化的关系需要未来进行研究；（3）本研究显示外泌体miR-22-3p对类风湿性关节炎有一定诊断价值，但是如何进一步提高灵敏度和特异度仍需研究。

综上所述，本研究发现类风湿性关节炎患者血清外泌体miR-22-3p 表达水平升高，对疾病早期诊断有一定价值。血清外泌体miR-22-3p与疾病活动性和影像学进展相关，可能成为类风湿性关节炎的生物学指标。未来需要深入探讨miR-22-3p在类风湿性关节炎发生及发展中的机制。