基于低分散激光剥蚀系统-电感耦合等离子体飞行时间质谱的快速元素成像

李冬月 郑令娜 常盼盼 汪 冰 竺 云 王 萌* 丰伟悦

(1.天津师范大学 物理与材料科学学院，天津 300387；2.中国科学院高能物理研究所 中科院纳米生物效应与安全性重点实验室，北京 100049)

生物体内的微量元素虽然含量低，却参与许多重要的生理过程，还与多种疾病的发生密切相关[1]。随着科学研究的深入，不但需要得到生物样品中元素总量和元素形态的信息，还要获得样品中元素的空间分布，这为分析化学提出了新的挑战。

目前，生物体内元素原位成像的分析技术主要有激光电离质谱(Laser Desorption Mass Spectrometry，LDMS)[2]，二次离子质谱(Secondary Ion Mass Spectroscopy，SIMS)[3]、激光诱导击穿光谱(Laser Induced Breakdown Spectroscopy，LIBS)[4]、X射线荧光光谱(X-ray fluorescence，XRF)[5-6]和激光剥蚀-电感耦合等离子体质谱(Laser Ablation-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry，LA-ICP-MS)[7]。其中，LA-ICP-MS具有样品前处理简单，分析灵敏度高、线性范围广，空间分辨率高等优点，成为痕量元素原位成像的常用方法[8]。

在LA-ICP-MS进行生物元素成像分析时，高能量激光微束轰击剥蚀池中的生物切片表面，产生的气溶胶由载气吹扫进入ICP-MS，检测得到剥蚀区域的元素信息，再将切片上每个剥蚀微区的结果重构，得到元素成像图。由此可见，LA-ICP-MS是一种逐点成像的方法，成像速度主要受到气溶胶产生和传输、质谱分析速度等因素的影响。近几年出现了专用于元素成像的激光剥蚀系统，配有高频率的激光器(如大于100 Hz)，提高了样品剥蚀速度[9]。采用低分散(Low Dispersion)快速洗脱剥蚀池，单脉冲激光产生的气溶胶在剥蚀池中停留时间(即单脉冲响应，Single Pulse Response，SPR)缩短至10 ms以下[10]。同时，新一代电感耦合等离子体飞行时间质谱(ICP-TOFMS)可以在不到50 μs的时间内得到从6Li—238U的全质谱图[11]。上述分析仪器的发展，极大地提高了LA-ICP-MS成像速度。Vanhaecke组采用低分散激光剥蚀-电感耦合等离子体质谱实现了每秒250像素的快速元素成像[12]。LA-ICP-MS与免疫技术结合后(即成像质谱流式技术)能够以1 μm的分辨率在2 h内完成1 mm2大小样品的元素成像[13]。随着新一代LA-ICP-MS的发展，需要发展与之匹配的成像方法，以实现快速的生物元素成像。

银纳米颗粒(AgNP)是一种广谱抗菌、抗病毒和抗炎材料，随着AgNP在个人护理产品、保健品以及医疗用品等领域的广泛应用，AgNP在生物体内代谢和清除受到了广泛关注。肾脏是血液过滤和废物清除的主要器官，在体内纳米颗粒清除中起着关键作用。本文使用低分散激光剥蚀系统与电感耦合等离子体飞行时间质谱联用，建立了新的基于点剥蚀的成像模式，实现了对尾静脉注射AgNP小鼠肾脏切片的快速元素成像。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

ArF准分子激光剥蚀系统(Iridia Bio，美国Teledyne公司)，电感耦合等离子体飞行时间质谱(icpTOF 2R，瑞士TOFWERK AG公司)，气溶胶快速进样系统(ARIS，美国Teledyne公司)，冷冻切片机(LEICA 1900，德国Leica公司)。

高纯Ar气和He气购自北京普莱克斯公司。银纳米颗粒(AgNP，50 nm，柠檬酸修饰)购自上海沪正纳米科技有限公司。标准物质购NIST 612购自美国国家标准与技术研究院。Superfrost防脱玻片购自美国Thermo Fisher公司。

1.2 动物实验

本实验所用CD1(ICR)小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，体重20 g。小鼠尾静脉注射银纳米颗粒(剂量：6.25 mg/kg，注射体积：200 μL)，24 h后心脏灌流，取肾组织，快速冷冻后用冷冻切片机制成10 μm厚度的切片，干燥后置于干燥器中备用。

1.3 LA-ICP-TOFMS成像分析

LA与ICP-TOFMS使用ARIS系统连接。激光剥蚀产生的气溶胶由He气带出样品池，进入ICP-TOFMS分析。使用NIST 612标准参考物优化激光剥蚀系统和ICP-TOFMS的参数，使115In+的信号最强，同时将氧化物水平(UO+/U+)保持在较低水平。优化剥蚀池He气流速，以获得最佳的单脉冲响应值(SPR)。优化激光剥蚀能量密度，达到样品最优剥蚀效果并减少引入来自基底的干扰。优化后的LA-ICP-TOFMS参数见表1。LA采用点剥蚀模式，激光剥蚀时自动触发ICP-TOFMS以标准模式采集质谱数据。所得数据用HDIP 1.6软件(美国Teledyne公司)画出元素成像图。

表1 LA-ICP-TOFMS仪器参数Table 1 LA-ICP-TOFMS operating parameters

2 结果与讨论

2.1 快速成像条件

LA-ICP-MS的元素成像可采用点剥蚀模式或线剥蚀模式(图1)[14]。点剥蚀模式时，激光束在样品表面逐点剥蚀采样，等待剥蚀得到的气溶胶完全从剥蚀池洗脱后，再进行下一点剥蚀。此时，采集的数据真实反映每个采样点上的元素信息。激光光斑越小，采样点越多，得到的元素成像图的分辨率越高。但洗脱时间长的激光剥蚀系统若采用点剥蚀模式会导致成像时间过长。

图1 两种剥蚀模式示意图 A为点剥蚀模式，使用低分散快速剥蚀池；B为线剥蚀模式，使用常规剥蚀池Figure 1 Schematic diagram of two ablation modes.A：Spot ablation mode using a low dispersion ablation cell；B：Line ablation mode using a standard ablation cell.

线剥蚀模式时，激光束在样品表面沿直线连续剥蚀样品，不同样品微区产生的气溶胶会在剥蚀池内发生一定程度的混合。此时，成像的分辨率取决于光斑尺寸、激光频率、线扫描速率和剥蚀线间距等条件。线剥蚀模式具有很好的分析灵敏度，但由于不同样品微区产生的气溶胶会混合，造成了成像结果的失真。文献中已有的LA-ICP-MS成像分析，受到常规剥蚀池洗脱时间长(SPR：～1 s)的限制，多数采用线剥蚀模式以缩短成像时间[15]。

本文使用的低分散快速激光剥蚀系统，配备了快速洗脱剥蚀池和气溶胶快速引入系统(ARIS)，可以采用点剥蚀模式完成快速成像。优化剥蚀池载气流速，可以得到最佳的SPR。当内池He流量为0.4 L/min，外池He流量为0.2 L/min时，得到最佳SPR(20 ms±1 ms)，此时可以实现每秒40像素的成像速度。理论上越小的激光光斑能获得更高的空间分辨率，但由于成像时间的限制，本文采用20 μm的方形光斑。在点剥蚀模式下，样品台移动速度设为800 μm/s(20 μm×40 Hz)。

LA-ICP-MS成像还要求质谱仪具有快速分析瞬时信号的能力，同时能消除谱学偏离(Spectral Skew)产生的结果偏差[16]。顺序扫描的四级杆ICP-MS在测量时，每个核素测量需要毫秒量级的驻留时间(Dwell Time)和稳定时间(Settling Time)[17]，限制了其分析瞬时信号中核素的个数。与四级杆ICP-MS不同，本文采用的ICP-TOFMS分析速度快，能够在46 μs得到一张全质谱图(即波形，Waveform)，适合分析瞬时信号。为了获得更好的信噪比，本文将516张质谱图叠加，这样每个像素点的采样时间为23.74 ms，与SPR时间匹配以得到最优的成像结果。此外，在全谱测量时，由于存在高浓度的基体离子，会造成ICP-TOFMS检测器的饱和。本文使用的ICP-TOFMS采用陷波技术(Notch Filter)，选择将质荷比为28、32、40、80等四个质量数的基体离子去除，消除了基体离子的影响。

2.2 LA-ICP-TOFMS小鼠肾脏的元素成像

本文使用LA-ICP-MS对暴露AgNP的小鼠肾切片中Ag和其他多种生物微量元素快速成像，采用点剥蚀模式，以20 μm的分辨率分析尺寸为14 mm×7 mm的肾脏切片，分析时间约为2 h。与常规的LA-ICP-MS系统相比，成像速度提高了约一个数量级。

图2 展示了19种元素成像图，其他元素由于含量低或基体离子干扰，没有得到清晰的成像结果。如果采用碰撞池技术，可以消除多原子离子的干扰[18]，提高52Cr、56Fe、80Se等核素的成像效果。由图2可见，不同元素在肾切片中具有不同分布模式。P和S等主量元素，在肾脏切片基本呈均匀分布；Na在肾髓质中含量较高，这与Na+参与形成肾髓质高渗透压的结论相一致[19]；Mn与Na的分布相反，在肾髓质和肾皮质的交界处含量较高，而在肾椎体中含量较低，呈现出中空的图像；由于肾皮质中血流量远远大于肾髓质，因此肾皮质的Fe含量(主要来自血细胞)较高。Ag并不是生命必需元素，在生物体内的背景很低，因此图2中Ag的信号可以认为来自于注射的AgNP。可以看出，AgNP在肾皮质及肾皮质与肾髓质交界区域含量较高，特别是在肾皮质和肾髓质交界处的含量高于肾皮质区，而在肾椎体中含量很低。图3是P、Mn和Ag三种元素合并图，可以直观地看出不同元素在肾切片中的不同分布。总之，元素成像可以得到微量元素及金属纳米颗粒在不同微区的原位分布，为微量元素的微区代谢、金属纳米材料吸收、分布和转运等生物医学研究提供了直观可靠的分析手段。

图2 小鼠肾组织切片元素成像图Figure 2 Elemental images of a tissue section from a mouse kidney.

生物元素的定量成像需要制备基体匹配的标准物质。文献中已有使用定量掺杂金属的明胶切片作为基质匹配的标准物质，实现了生物样品的定量成像的报道[20]。如果将LA-ICP-TOFMS技术与免疫组织化学技术结合，使用金属标签标记的抗体，特异性识别组织样品中待测分子(抗原)，通过测量金属标签而得到生物切片中多种生物分子的原位分布，进一步扩展了LA-ICP-TOFMS技术的应用。Giesen等利用上述方法实现了对肿瘤组织的32 种生物分子的多重成像[21]。

图3 肾组织切片中P、Mn和Ag叠加元素成像图Figure 3 The merged image of P Mn and Ag of of a tissue section from a mouse kidney.

3 结论

本文使用低分散激光剥蚀系统与电感耦合等离子体飞行时间质谱联用，建立了新的基于点剥蚀的成像模式，实现了对小鼠肾脏切片的快速、高分辨的多元素成像。LA-ICP-TOFMS成像方法为原位研究生物体内元素提供了直观可靠的手段，有望在生物医学研究中得到更广泛的应用。