基于大科学装置的空间金属组学和单细胞/单颗粒金属组学
2022-09-22范玉芹崔丽巍王黎明赵甲亭李玉锋
范玉芹 崔丽巍 王黎明 赵甲亭 李 柏 李玉锋*
(1.山东省妇幼保健院,济南 250014;2.中国科学院大学 资源与环境学院,北京 100049;3.中国科学院高能物理研究所 中国科学院-香港大学金属组学与健康和环境联合实验室/中国科学院纳米生物效应与安全性重点实验/北京金属组学平台,北京 100049)
金属组学(Metallomics)是综合研究生命体内(特别是细胞内)自由或络合的全部金属原子的分布、含量、化学种态及其功能的一门学科[1-2]。细胞、器官或组织中金属/类金属蛋白质、酶或其他含有金属/类金属的生物分子及游离金属/类金属离子的集合则称之为“金属组(Metallome)”,即生物体系中的所有含金属/类金属物种[3-4]。
与基因组学、代谢组学及蛋白质组学等组学技术不同,金属组学侧重从原子层面研究生物体系和生命过程[5],这与离子组学(Ionomics)类似[6-8],但是金属组学也从分子层面研究生物体系和生命过程,如金属蛋白质组学(Metalloproteomics)[9]等。随着分析方法的进步,特别是机器学习及人工智能技术的发展,金属组学最终可升级为元素组学(Elementomics),即以元素周期表中的所有元素为研究对象[10-12]。
本文将首先介绍金属组学发展简史,然后介绍基于大科学装置的同步辐射技术、中子技术、质子技术及缪子技术等,最后概述基于大科学装置的空间金属组学、单细胞/单颗粒金属组学的应用。
1 金属组学发展简史
金属组学概念自2002年提出后,得到了学术界的广泛关注[2,13-16]。金属组学与其他学科领域的交叉融合,逐渐了产生新的学科方向,如纳米金属组学(Nanometallomics)[17-19]、环境金属组学(Environmetallomics)[20-21]、农业金属组学(Agrometallomics)[22-24]、放射金属组学(Radiometallomics)[25]、临床金属组学(Clinimetallomics)[26-28]、计量金属组学(Metrometallomics)[29]等,特别是金属组学与考古学、材料科学的融合,形成了考古金属组学(Archaeometallomics)[30]、材料金属组学(Matermetallomics)[31]等,将金属组学研究从生命体系进一步扩展到了非生命体系。
在金属组学方法学方面,已经提出了比较金属组学(Comparative Metallomics)[19,32]、非靶标金属组学(Non-targeted Metallomics)[33]、单细胞/单颗粒金属组学(Single-cell/Single-particle Metallomics)及空间金属组学(Spatial Metallomics)[34]等。
空间金属组学研究特定体系特别是生命体系中金属组的空间分布情况,而单细胞/单颗粒金属组学研究单细胞/单颗粒中金属组的空间分布情况。因此,单细胞/单颗粒金属组学可以看作是空间金属组学在单细胞/单颗粒研究中的应用。
2 基于大科学装置的同步辐射、中子、质子及缪子技术
大科学装置(Large Research Infrastructures)是指通过较大规模投入和工程建设来完成,建成后通过长期的稳定运行和持续的科学技术活动,实现重要科学技术目标的大型设施。大科学装置的主要特点是[35-36]:1)科学技术意义重大,影响面广且长远,同时建设规模和耗资大,建设时间长;2)需要在建设中研制大量非标设备,具有工程与研制的双重性;3)其产出是科学知识和技术成果,而不是直接的经济效益等。北京同步辐射装置、合肥同步辐射装置、上海光源及中国散裂中子源就是这样一类大科学装置[37-38]。
同步辐射(Synchrotron Radiation)是速度接近光速的带电粒子在作曲线运动时沿轨道切线方向发出的电磁辐射,具有如下特性[37-39]:1)宽波段。波长覆盖从远红外直到X射线范围内的连续光谱;2)高亮度。具有很高的辐射功率和功率密度,是普通X光机的上亿倍;3)窄脉冲。具有低至纳秒的脉冲时间结构;4)高准直性。几乎是平行光束,可与激光媲美,特别是自由电子激光[40]等。
高通量中子束流主要来自核反应堆[41]和散裂中子源[42]。核反应堆是一种稳定的连续中子源,其中子来源是核裂变过程释放的中子,中子束通量由核反应功率决定,通常使用235U作为核燃料。由于散热条通量条件的限制,反应堆的中子通量目前已达到极限,目前公认中子束通量最高的是法国ILL研究用堆,约为1.2×1015n/(cm2·s)[41]。散裂中子源中子通量比反应堆中子通量提高100倍以上且波段更宽,它是由加速器加速到GeV 能量的质子轰击重金属靶而产生中子束流的大科学装置,而加速器产生的质子束流也可以直接用作激发源[43]。
缪子(Muon)是第二代轻子,其质量是质子质量的1/9,电子质量的207倍,带一个单位电荷,主要来源于宇宙射线和加速器[44],宇宙射线缪子能量高,穿透性强,是一种天然的非破坏性基本粒子“探针”,可以对物体进行无损成像检测。加速器缪子强度高,能量可调,可以对物体快速成像。加速器产生的负缪粒子进入材料会形成缪子原子,级联跃迁产生的X射线可以对材料进行元素分析[44-45]。
3 基于大科学装置的分析方法学
同步辐射光、中子、质子及缪子与物质的相互作用可分为三类[42-43,45-47],这也构成了基于大科学装置的分析方法学:
1)吸收。相应的技术包括X-射线吸收光谱(X-ray Absorption Spectroscopy,XAS),软/硬X-射线成像技术(扫描透射X-射线成像技术,Scanning Transmission X-ray Microscopy,STXM;透射X-射线成像技术,Transmission X-ray Microscopy,TXM,TXM也叫X-射线断层扫描技术,X-ray Computed Tomography,X-CT)及缪子成像(Muonic Imaging)等;
2)散射。相应的技术包括X-射线衍射谱(X-ray Diffraction,XRD)、蛋白晶体衍射谱(Protein X-ray Crystal Diffraction,PX)、小角X射线散射(Small Angle X-ray Scattering,SAXS)、小角中子散射(Small Angle Neutron Scattering,SANS)等;
3)二次激发。相应的技术包括中子活化分析(Neutron Activation Analysis,NAA),X-射线光电子能谱(X-ray Photoelectron Spectroscopy,XPS)、X-射线荧光谱(X-ray Fluorescence Spectrometry,XRF)、质子激发X射线发射谱(Proton Induced X-ray Emission,PIXE)及缪子X射线荧光谱(Muonic X-ray Analysis,MXA)等。
4 基于大科学装置的空间金属组学和单细胞/单颗粒金属组学
大科学装置为空间金属组学及单细胞/单颗粒金属组学提供了先进的分析方法并应用于多个学科领域[48-49]。
4.1 空间金属组学
研究金属组在特定体系特别是生命体系中的分布,通常可以通过非原位和原位两种方式实现,分别称为非原位空间金属组学和原位空间金属组学。
4.1.1 非原位空间金属组学
非原位空间金属组学首先分离实验对象的不同脏器、组织,然后对其中的金属组分别进行定量分析,再整合不同脏器、组织的数据,从而获得金属组在生命体系中的空间分布情况,特别是确定金属药物的靶器官、靶组织。
基于大科学装置的NAA、XRF、PIXE等是非原位空间金属组学研究中常用的分析手段。
NAA技术是利用中子轰击样品,样品发生中子捕获生成放射性核素,放射性核素衰变时发射β粒子和γ射线。通过检测样品受中子照射后产生的γ射线的强度即可实现对样品中元素定量分析,它可以同时测定样品中多达30种元素的含量,绝对检测限可低至10-6~10-13g[50-51]。
XRF技术利用X射线逐出样品原子中的内层电子从而使整个原子体系处于激发态,当较外层的电子跃入内层空穴所释放的能量以辐射形式放出时产生特征X 射线荧光,而荧光强度与相应元素的含量有一定的关系,据此可以进行元素定性和定量分析[52]。XRF可同时对元素周期表中大部分元素进行分析,特别是从Na到U。基于同步辐射装置的XRF,可实现绝对检测限10-12~10-15g,相对检测限可达ng/g水平[53-54]。与XRF不同,PIXE采用质子束流作激发源进行X射线荧光分析,具有比普通XRF更高的灵敏度[55]。
LI等[56]利用NAA技术研究了稀土元素Sm和Yb在大鼠体内的分布情况,发现静脉注射的Sm和Yb能迅速被吸收并分布到肝、骨、肾、脾、心脏等脏器中且主要分布在肝和骨中,表明肝和骨是这两种元素的靶器官。另外,脑中稀土元素含量高于血液中含量,并能在脑中长期滞留。对脑不同区域进行分析,发现稀土元素主要分布在下丘脑、海马和小脑等区域[57-58],这为理解稀土元素的神经毒性机制提供了重要支持。
利用XRF对乳腺癌组织、癌旁组织和正常组织进行金属组学分析发现,乳腺癌组织内Ca、Cu及Zn水平明显降低[59],而前列腺癌组织S、K、Ca、Fe、Zn及Rb的含量明显降低[60]。这些发现可为发展癌症诊断或治疗的新方法提供支持[33,61]。
VIRK等[62]利用PIXE发现暴露As后大鼠肝脏中As主要分布于分子量大于50 kDa的蛋白组分中,且S、Ca及Mn含量在该蛋白组分中减少但在分子量10~50 kDa的蛋白组分中增加。黄炎[63]利用PIXE等技术发现患病大熊猫毛发中K、Ca和Zn,肝中K和Fe高于正常大熊猫,而人工饲养大熊猫毛发中Cu、Fe、Zn、Mn、Ca和Mg低于野生大熊猫,这些结果为人工饲养大熊猫提供了重要参考资料。
以上基于大科学装置的NAA、XRF以及PIXE技术通常受限于机时的限制,特别是NAA技术还存在放射性风险,在非原位金属组学研究中的应用呈减少趋势,而商业化仪器如ICP-OES及ICP-MS等则是目前开展非原位金属组学的更常用手段[64-65]。
非原位空间金属组学是将整个脏器、组织中金属组的平均含量代表该组织的含量,或者将脏器再进一步进行分区,但金属组在该组织或亚组织中分布可能存在空间差异,因此需要开展原位空间金属组学研究。
4.1.2 原位空间金属组学
原位空间金属组学是对样品中的金属组进行原位分析,从而获得其空间分布信息。它既包括对脏器、组织切片进行原位分析,也包括对整体实验动物、植物进行原位分析。从空间维度上看,既包含二维空间分布分析也包含三维空间分布分析,若加上时间维度,则称为时空金属组学(Spatiotemporal Metallomics,STM)。
利用一定尺寸光斑的X射线或质子束流在样品不同位置进行逐点扫描,收集相应的荧光信号,通过分析即可原位获得样品中金属组的二维乃至三维分布信息,该方法的空间分辨率主要取决于入射X射线或者质子束流的聚焦尺寸及扫描步长。除通过扫描方式外,还可以通过投影(Projection)方式获得样品金属组的空间分布信息[66-68],这一方法的空间分辨率取决于探测器的像素分辨率及入射X射线和束流的尺寸。
WANG等[69]利用同步辐射XRF(光斑尺寸400 μm×600 μm)发现经鼻滴注TiO2纳米颗粒后,Ti能进入小鼠嗅球,且嗅球中Fe、Cu及Zn等必需微量元素的分布发生了改变,表明TiO2纳米颗粒可引起神经毒性,这是人造纳米颗粒能通过嗅球入脑的直接证据[69-71]。
ZHAO等[72]利用同步辐射XRF(光斑尺寸5 μm×5 μm)研究了硒暴露对水稻不同部位汞分布的影响,发现未暴露硒时,汞主要分布于水稻根表及中柱,而加入硒后,水稻根表及中柱中汞含量明显减少。米粒中的汞主要分布于糊粉层及胚,而硒同样减少米粒中的汞。另外,米粒中的必需微量元素如Fe、Cu、Zn、K及Ca等也主要分布在糊粉层,且硒既可减少米粒中甲基汞含量还可增加米粒中微量元素的含量[73]。这一发现为汞污染农田修复打下了良好基础[74-79]。CUI等[80]利用同步辐射XRF研究了硒在超富集植物碎米荠不同部位的分布情况,发现硒通过内皮层及维管束从根部传输到茎部,并通过叶脉向叶边缘输送,从而减轻硒对植物的损害,为揭示碎米荠超富集硒机制打下良好基础(图1)。
图1 利用同步辐射XRF研究硒在碎米荠不同部位的二维分布情况,为揭示碎米荠超富集硒机制打下基础(图片改编自参考文献[80],已获得使用许可)Figure 1 Two dimensional study of the distribution of selenium in Cardamine enshiensis(adapted from Ref.[80],Permission was obtained from Springer).
秀丽线虫体长约1 mm,因此可以利用同步辐射XRF(光斑尺寸3 μm×5 μm)直接研究金属组在整条线虫不同部位的分布情况。GAO等[81]对暴露于纳米铜的线虫体内元素分布进行研究,发现纳米铜暴露后,线虫体内Cu、K含量明显增加,且Cu主要分布于头部及近尾部。QU等[82]发现,CdSe量子点被线虫摄入后,可以从消化系统进入生殖系统并产生累积毒性。
由于同步辐射X射线光斑尺寸通常只有1 mm×1 mm,若采用这种尺寸的X射线对较大样品(如小动物)开展原位空间金属组分布研究,通常非常耗时,这也影响了对整体小动物体内原位空间金属组研究[83]。RADTKE等[84]通过采用更大的发散度及调节准直狭缝尺寸,获得宽度为10 mm的线光源,利用线扫描模式,实现了大黄蜂体内金属组分布研究。DE SAMBER等[85]利用光学器件放大点光源,从而获得线光源开展大型溞体内原位空间金属组学研究。BAUMANN等[86]则通过去焦化光学器件成功获得1 mm×5 mm的X射线光斑,同样利用线扫描模式,可实现对大鼠体内金属组分布研究。GRUNER等[87]发展了一种可望用于人体大小样品的XRF数据处理方法,为开展大型动、植物原位空间金属组学研究打下了良好基础。
由于X射线,特别是基于大科学装置的高能X射线本身具有更强的穿透能力,因此人们通过探测来自样品不同深度的X射线荧光强度[48]发展了非侵入性的三维原位空间金属组学方法,包括同步辐射全场荧光CT(Full-Field XRF Computed Tomography)[88-90]和共聚焦XRF(Confocal XRF)[91-92]两种模式。由于同步辐射全场荧光CT需要对整个样品进行180°甚至360°扫描,其空间分辨率为μm量级[88,93-94],故该法更适合研究小样品,如植物根中Pb和Fe的三维分布[95]、Ni超富集植物茎、叶中Ni、Mn及Ca的三维分布等[96]。采用共聚焦模式的XRF的探测深度可达10 μm。这一模式是将X射线聚焦于样品内部的某一位置,而不是对样品进行整体扫描,因此可用于较大尺寸样品的原位空间金属组学研究,如植物根[97]、人体骨关节[98]等。基于X射线的三维原位空间金属组学方法的优点是可以直接对较大样品进行无损原位快速分析[99],但采用共聚焦模式时,考虑到样品自身对入射X射线及所产生X射线荧光的吸收,故所能探测到样品深度受到一定限制[87]。
微区扫描PIXE技术也已用于原位研究动、植物组织中金属组的二维分布[100-102]。利用CT原理,三维微区扫描PIXE也已研制成功,其空间分辨率可达4 μm,并已用于蚂蚁、果蝇及线虫的原位空间金属组活体研究[103-105]。
由于缪子是电子质量的207倍,故负缪子轰击样品产生的X射线能量更高,这也使得缪子X射线分析方法对低质量数元素也很敏感[106-107],同时也能开展样品中原位空间金属组学分析[108]。基于宇宙线缪子源的MXA技术已经用于火山、建筑物(如金字塔)等大型物体的三维成像[109]。基于加速器缪子源的MXA技术也已用于文物分析[110-111]、生物组织分析[112-113]及无损同位素分析[114]等。
上文提到,研究金属组空间分布随时间变化的趋势称为时空金属组学(STM)。采用扫描方式开展空间金属组学研究时,其获得二维图像的采样时间依样品尺寸不同,通常需要几十分钟甚至几个小时,而获得三维图像则需要几十个小时甚至几天,因此通常无法开展STM研究。采用飞扫模式(Fly-scan Mode)虽然可以大大降低采样时间,使得开展二维STM研究成为可能[115-116],但开展三维STM研究仍有困难。另一方面,采用投影方式的二维或三维空间金属组学研究由于是对样品进行整体扫描,采谱时间为分钟乃至秒量级[117],使得开展二维甚至三维STM研究成为可能。JUNG等[118]利用全场荧光CT研究了尾静脉注射金纳米颗粒后其在小鼠右肾中的分布变化情况,发现右肾中金含量从开始测量时的1.58%降低到60 min时的0.77%。SHAKER等[119]研究了MoO2纳米粒子在小鼠肝中变化情况,发现注射1 h后肝中Mo含量占总量的40%~50%,而7 d后降为20%。
4.2 单细胞/单颗粒金属组学
细胞是生命活动的基本单元,即使同一类型的细胞之间仍然存在个体差异。为了如实地反映细胞在结构和功能上对生物系统的正常运转所起到的作用,就要求从单细胞乃至亚细胞水平上对细胞中物质的组成和含量进行分析研究。单细胞金属组学就是从单细胞水平上研究金属组[34],实际上金属组学概念自提出时就着眼于研究单细胞内的金属组[1]。由于大气颗粒物的尺寸与细胞尺寸在同一量级,因此,单细胞金属组学的一些分析手段同样可用于单颗粒金属组学研究,特别是还可用于生物大分子结构解析[120]。
单细胞金属组学也可分为非原位和原位两种方式。将细胞破碎后进行差速离心以分离出不同细胞器,然后分析金属组在不同细胞器的含量,是非原位单细胞金属组学的研究方式。LI等[56]利用NAA技术研究了Sm和Yb在大鼠肝脏细胞中的亚细胞分布情况,发现线粒体中含量最高而细胞核中含量最低,说明稀土元素更容易被线粒体吸收从而影响其功能。
随着光学聚焦技术的发展,可以将同步辐射X射线[121]或者质子束[122]聚焦到纳米尺寸,从而可以开展原位单细胞金属组学研究。YANG等[123]利用200 nm×200 nm分辨率的SRXRF,发现细胞内Cu主要分布于线粒体和高尔基体等细胞器中。CARMONA等[124]利用光斑尺寸为90 nm×90 nm的X射线发现,多巴胺囊泡中的Fe主要以颗粒状分布于神经突及神经末梢,且不同细胞的神经突均可蓄集Cu、Zn甚至Pb元素。YAN等[125]甚至利用聚焦后的X射线(光斑尺寸13 nm×33)研究了染色体中Ag、Pt、Ba及Cl的分布情况。这是扫描方式在单细胞空间金属组学中的应用。
投影方式也可以原位获得单细胞金属组空间分布信息。TXM技术以及X-CT技术,空间分辨率可低至15 nm[126],因此非常适合开展单细胞三维形貌研究,结合比较样品中不同元素对X射线吸收差异,可获得元素在单细胞中三维分布情况。WANG等[127]利用纳米TXM技术研究了银纳米颗粒(AgNP)在人血单核细胞(THP-1)中的分布情况,发现AgNP聚集于胞浆中的胞内体、溶酶体及细胞核中。他们也研究了AgNP不同时间点时在单细胞中的分布情况,发现24 h时细胞内含量最高,而48 h后大部分AgNP已被排出细胞外,这也是单细胞时空金属组学(Single-cell STM)的应用示例(图2)。
图2 银纳米颗粒在单个THP-1细胞中的时空金属组学研究(图片来源于参考文献[127],已获得使用许可)Figure 2 Spatiotemporal metallomics study on AgNP in THP-1(Ref.[127],Permission was obtained from American chemical society).
软X射线STXM的分辨率可低至10 nm,且可以直接研究含水样品,因此可用于研究单细胞样品,结合元素对不同入射X射线吸收差异,获得特定元素在细胞中的分布情况[128]。CHEN等[129]研究了Gd@C82(OH)22中的Gd元素在单个巨噬细胞中的时空分布情况,发现Gd主要分布于巨噬细胞的胞浆中,且注射48 h后细胞内Gd含量仍在增加。
软X射线STXM也已用于单个大气颗粒中元素分布研究,即单颗粒金属组学。DING等[130]综合利用XRF及STXM研究了单个大气颗粒物中元素分布情况,利用XRF发现单个大气颗粒物中含有Fe、Ca、Si、K及Mn等元素,且Fe含量最高,而利用STXM可获得Fe元素在单个大气颗粒物中的三维分布情况,表明Fe主要分布于大气颗粒物的近表面,这也为解释大气颗粒物的环境健康效应打下了良好基础[131]。
5 结语
总之,大科学装置为空间金属组学、单细胞/单颗粒金属组学乃至时空金属组学研究提供了先进的手段,既可以开展非原位空间金属组学研究,还可开展原位空间金属组学研究,既包含空间维度,还包含时间维度。NAA、XRF以及PIXE技术已被用于开展非原位空间金属组学研究,而XRF、PIXE以及MXA为开展原位空间金属组学提供了有力工具,特别是基于XRF的技术,其空间分辨率可低至10 nm级别,是开展原位单细胞/单颗粒金属组学的利器。另一方面,通过利用光学元件调整X射线光斑尺寸,使得利用XRF技术开展人体研究成为可能。随着新一代质子源及缪子源的建设,基于质子源及缪子源的PIXE技术及MXA技术也有望在空间金属组学、特别是时空金属组学研究中获得更广泛应用。