核酸工具酶辅助的金属稳定同位素标记方法在生物分析中的应用

周 静 李紫嫣 胡建煜 刘 睿 吕 弋，*

(1.四川大学 分析测试中心，成都 610064；2.四川大学 化学学院，成都 610064)

生命科学的研究在21世纪进入了发展的新时代，为了更好地理解给定的生物系统，我们必须获得生物分子的准确定量信息，以直接反映系统的客观状态。例如，对蛋白质和核酸，以及癌细胞、细菌和病毒等生物体的分析检测有助于疾病诊断和生命科学的研究发展。为了满足这一生物学研究要求，研究人员必须不断开发新的分析技术来适应各种不同的检测需求。核酸工具酶是一种广泛应用于基因工程技术中的可以对核酸进行精确剪切、连接、修饰等作用的工具，因其具有序列识别特异性高、催化活性高、反应条件比较温和以及生物相容性良好等优点而备受关注。另一方面，电感耦合等离子体质谱(Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry，ICP-MS)作为一种强大的元素定量工具，在近年也被广泛地应用到了食品检验、地质分析、环境监测以及生物分析当中[1-3]。近些年，一些将核酸工具酶和金属稳定同位素标记方法两者的优点相结合建立起来的方法也被应用到了生物分析中，并展现出良好的发展前景。

1 方法简介

1.1 核酸工具酶

核酸工具酶是一种广泛应用于基因工程技术中的可以对核酸进行精确剪切、连接、修饰等作用的工具[4]。随着核酸工具酶的不断发展，越来越多的核酸工具酶被陆续报道，多种核酸工具酶已被用作“纳米工具”，用于操纵生物体内不同的核酸底物，根据它们对作用底物的偏好，大致可以将它们分为聚合酶、核酸酶、限制酶和修饰酶等几个大类[5]，其中以聚合酶和核酸酶在生物分析中的应用最为广泛[6]。除了这些常见的核酸工具酶以外，一些自身拥有特殊性质的核酸工具酶也能够为生物活性分子的检测提供一些新的设计思路。例如，簇状规则间隔的短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR)和相关蛋白组成的CRISPR-Cas系统和DNA酶，因具有独特的生物识别能力和核酸酶活性，也在生物分析领域中被广泛使用[7]。

1.2 基于金属稳定同位素标记的ICP-MS检测方法

ICP-MS作为一种强大的元素定量工具，对大多数的元素测定都具有较高的灵敏度[8]，这使得大多数的元素和同位素都可被用作元素标签，基于ICP-MS强大的元素及同位素定量功能发展出了金属稳定同位素标记方法[9]，该方法由清华大学张新荣教授在2001年首次提出，并在之后的20多年得到了快速发展。基于金属稳定同位素标记的ICP-MS检测方法已被广泛应用于生物分析领域中的蛋白质和核酸等生物活性分子的分析检测中[9-11]。同时，由于该方法拥有出色的质量分辨率和强大的多元素同时检测功能，可以有效避免常用光学方法中多波长激发和光谱重叠的问题[12-13]，使其在多组分检测中具有非常可观的应用前景。在基于金属稳定同位素标记的ICP-MS分析策略中，元素标签主要包含金属离子标签和金属纳米颗粒标签两大类。

1.2.1 金属离子标签

金属离子标签主要是指以金属离子的形式与报告分子连接进行标记并实现信号的输出，广泛使用的是含1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)或聚合戊酸(DPTA)等金属螯合配体的大环化合物来装载水溶液中的稀土金属阳离子，然后再通过一些生物偶联反应与寡核苷酸或抗体连接，来实现标记[14]，用于装载金属阳离子的大环化合物既有单个配体的也有含多个配体的[15]。常用的金属离子标签主要是稀土金属元素，例如早期使用的铕离子(Eu3+)标记的链霉亲和素[16]。

1.2.2 金属纳米颗粒标签

与金属离子标签相比，金属纳米颗粒标签可以得到更强的元素信号。因为一条寡核苷酸或者一个抗体只能连接一个螯合了金属离子的大环化合物，也只能接上一个金属纳米颗粒。但一个金属纳米颗粒含有多个金属原子，消解后在ICP-MS中可检测到更强的信号[13，17]。研究表明，用金属纳米颗粒标签取代用大环化合物装载的稀土金属离子标签，可以有效地提高金属稳定同位素标记方法的灵敏度[18]。金、银、铂等稳定金属的纳米颗粒是最常用的几种纳米颗粒标签，另外近年来还发展出了镧系纳米颗粒、金属元素量子点以及金属纳米簇等作为金属纳米颗粒标签[19-22]。

2 核酸酶辅助的基于金属稳定同位素标记的ICP-MS检测方法在生物分析中的应用

2.1 蛋白质检测

基于金属稳定同位素标记的ICP-MS分析方法在蛋白质检测中的应用，主要集中于对抗原抗体以及酶活性的检测。根据不同酶识别和切割底物的特性，或者抗原抗体之间的相互作用，可以建立对酶活性或抗原抗体的检测方法。例如在该方法被首次报导的研究中，利用了抗原抗体的经典三明治结构来捕获促甲状腺激素(TSH)，同时在抗体上修饰生物素，利用生物素与链霉亲和素之间强烈的相互作用将修饰了链霉亲和素的铕离子(Eu3+)与之连接，以将镧系金属元素Eu作为标签元素通过ICP-MS检测实现对TSH的定量检测[16]。以及后来又利用金-硫键(Au-S)将AuNPs标记在抗体上用于抗原检测[17]，这些都为之后的相关研究打好了基础。

一种基于LA-ICP-MS(激光烧蚀-电感耦合等离子体质谱)的微阵列免疫测定方法在2007年被报导，将抗体与不同的金属离子或纳米颗粒偶联，结合LA-ICP-MS能够检测具有微米级的空间分辨率的固体样品的优势，可以在微阵列的每个点检测到多种蛋白质[23]。根据金属螯合大环化合物的原理，张新荣课题组又提出了一种基于金属稳定同位素标记的多种蛋白组合免疫分析方法(图1)，该方法选择了大环金属螯合物SCN-DPTA去装载不同的稀土金属离子，并利用抗体-抗原反应进行特异性识别，实现了12种生物标志物蛋白的同时测定[24]。

图1 a)SCN-DTPA装载稀土元素标记上抗体流程示意图；b)多组分蛋白组合免疫分析示意图[24]Figure 1 a) Schematic diagram of SCN-DTPA loading with rare earth element-tagged antibodies；b) Schematic diagram of multi-component protein combinatorial immunoassay[24].

2009年，张新荣课题组提出了单颗粒ICP-MS(SP-ICP-MS)的检测方法，将ICP-MS传统的积分模式检测替换为在时间分辨模式下记录由等离子体炬中离子闪烁引起的瞬态信号来对目标物进行检测[25]。在一定条件下，瞬态信号频率可直接反应纳米颗粒标签的浓度，因此可以通过检测瞬态信号频率来量化被纳米颗粒标记的抗体浓度。SP-ICP-MS方法的提出为金属纳米颗粒标签提供了一种灵敏的读出方法，为基于金属稳定同位素标记的ICP-MS检测方法在生物分析中的应用提供了更多的可能性，由于SP-ICP-MS的优异性能，研究人员们也已经发表了许多相关的研究工作[26-28]。

而对于酶活性的检测，主要是基于酶自身的相关性质来建立方法，例如根据核酸外切酶Exo I可以从ssDNA的3末端进行剪切的能力(图2)，LIU等[29]

图2 a)Exo I介导的无标记ICP-MS法测定Exo I示意图[29]；b)SP-ICP-MS检测UDG活性方法示意图[30]；c)无标记基于DNA模板化方法检测CRISPR-Cas9示意图[31]Figure 2 Schematic diagram a) Exo I-mediated Exo I detection by label-free ICP-MS；b) UDG activity detection by SP-ICP-MS；c) CRISPR-Cas9 detection based on label-free DNA-templated CuNPs method[31].

建立了一种长期稳定的无标记ICP-MS方法用于测定Exo I酶。以及LI等[30]报道了一种基于单颗粒ICP-MS检测模式(SP-ICP-MS)的尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)活性检测方法，该方法中利用了UDG能够特异性识别和去除尿嘧啶以诱导DNA探针切割的能力，以及内切酶IV(Endo IV)对AP位点(无嘌呤/无嘧啶位点)的特异性剪切能力来释放元素信号。基于CRISPR-Cas9系统切割目标核酸底物的性质，HU等[31]提出了一种基于DNA模板化的铜纳米颗粒(CuNPs)的无标记方法用于检测CRISPR-Cas9。

2.2 核酸检测

与蛋白质检测相比，核酸工具酶辅助的基于金属稳定同位素标记的ICP-MS生物分析方法在核酸检测中的应用更为广泛。HAN等[32]首次提出了关于巯基功能化的DNA与大环化合物共价结合来对DNA进行标记的方法(图3a)。该方法利用DNA杂交反应进行特异性识别，结合磁珠快速分离的优点，通过Y、La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb和Lu的元素标签实现了15个与临床疾病相关的DNA靶标的同时测定，如图3b所示。LUO等[33]将这种标记DNA的方法与DNA聚合酶和DNA连接酶辅助的核酸滚环扩增方法结合实现了对三种病毒DNA(HIV、HAV、HBV)的超灵敏同时测定。

图3 基于巯基功能化DNA和大环化合物标记的多组分检测方法示意图。a)标记原理；b)检测原理[32]；c)Endon IV辅助的AuNPs标记方法用于DNA检测[34]；d)CRISPR-Cas12a辅助的AuNPs标记方法用于DNA检测[35]Figure 3 Schematic diagrams of the multi-component detection method based on thiol-functionalized DNA and macrocycle tagging.a) Tagging principle；b) Detection principle；c) Endon IV-assisted labeling of AuNPs for DNA detection；d) CRISPR-Cas12a-assisted AuNPs-tagging for DNA detection[35].

巯基功能化的核酸也可与金纳米颗粒通过Au—S键来进行标记，WANG等[34]利用这种标记方法与核酸内切酶IV(Endon IV)相结合，通过内标元素校正和AuNPs标记的DNA探针得到的比率型信号，提高了检测结果的精确度，并成功应用到了DNA检测中(如图3c)。我们也将这种标记方法与CRISPR-Cas12a这种具有核酸酶功能的特殊体系对非目标单链DNA高效地反式剪切能力结合(如图3d)，同时利用AuNPs在ICP-MS中可测得强信号的优势，建立了对于HIV-DNA的灵敏检测方法，检测限可低至amol[35]。

多种疾病相关microRNA的定量检测对临床诊断具有重要意义，基于金属稳定同位素标记的ICP-MS检测方法具有强大的多元素测得功能，该方法也被应用到了一些疾病相关microRNA的多组分测定当中。ZHANG等[36]报告了一种多组分microRNA测定的方法，如图4所示，他们将镧系元素标记的巯基功能化的DNA探针，与双链特异性核酸酶(DSN)可水解双链DNA或DNA-RNA异质双链中的DNA，并且不会切割ssDNA或RNA的特殊性能相结合，提出了一种可检测的多个镧系金属元素标签作为多重扩增方法用于多组分microRNA的检测。当目标microRNA与DNA探针互补形成双链后，DSN可对DNA探针进行剪切释放出元素信号，同时也释放出目标microRNA又可以进入新一轮的DSN剪切反应，如此循环重复可以释放出大量的元素信号。

图4 DSN辅助的镧系元素标记方法用于microRNA多组分检测[36]Figure 4 Schematic diagrams of DSN-assisted lanthanide-tagging method for multicomponent microRNA detection[36].

DNA酶(DNAzyme)与常见的核酸工具酶是蛋白质的本质不同，它是一种具有催化活性的DNA序列。DNA酶通常通过氧化底物、裂解DNA输出生物信号。KANG等[37]将DNA酶和镧系金属元素标记方法结合，建立了对于3种疾病标志物的microRNA的进行同时检测的生物分析方法。如图5a所示，每条microRNA对应一个DNA酶的A部分和B部分、一个底物链和一种镧系金属元素标签。三种不同的microRNA各自对应的底物链被固定在SA-MB上，在目标microRNA存在的情况下，组装了三对DNA酶，它们可以与各自对应的microRNA杂交，随后SA-MB上的底物链在Mg2+的催化作用下被这些DNA酶切割，连续释放出带有不同镧系金属元素标签的DNA片段。经磁性分离后收集上清液中释放出的镧系金属元素标签，进行ICP-MS分析，即可实现多个microRNA的同时定量检测。使用金属稳定同位素标记的ICP-MS检测方法对于多组分同时定量，具有光谱干扰低，灵敏度高，选择性好，对复杂基质抗性强等优点。

图5 a)基于DNA酶辅助的镧系元素标记方法用于microRNA多组分检测[37]；b)CRISPR-Cas12a辅助的镧系元素标记生物分析方法用于Kana检测[38]Figure 5 Schematic diagrams of a) DNAzyme-assisted lanthanide-tagging method for multicomponent microRNA detection[37]；b) CRISPR-Cas12a-assisted lanthanide-tagging bioanalytical methods for Kana detection[38].

2.3 小分子检测

除了应用到核酸和蛋白质检测中，基于金属稳定同位素标记的ICP-MS检测方法还可与核酸适配体结合，用于一些小分子的定量检测。例如，HU等[38]结合核酸适配体与目标物之间的特异性识别作用，采用巯基功能化的DNA和大环化合物共价结合的标记方法，建立了用于检测野生鱼样本中卡那霉素(Kana)含量的检测方法(如图5b)。可以通过这样一些间接的方式实现对目标小分子的识别，再结合基于金属稳定同位素标记的ICP-MS检测方法，来实现一些其他小分子的分析检测。

3 结语

核酸工具酶辅助的金属稳定同位素标记的ICP-MS检测方法逐渐在生物分析领域中占领一定的地位。对于多组分同时检测，该方法是传统光谱分析方法的有效代替品，甚至在灵敏度和分辨率方面比传统光谱方法拥有更良好的性能。对于生物分析而言，在建立方法时如何降低生物基质的干扰也是需要考虑的因素，基于金属稳定同位素标记的ICP-MS检测方法可以很好地满足这一条件。

总之，核酸工具酶辅助的金属稳定同位素标记的ICP-MS检测方法在生物分析中的应用潜力是不可忽视的，除了列在文中的这些生物分析方法以外，还有很多基于该方法的生物传感平台已经被大量报道。拥有质量分辨率高、基质干扰较小等优点的ICP-MS检测方法是生物分析领域发展研究中可靠的帮手。传统光谱分析方法更适用于现场检测、初步筛查等场景，而金属稳定同位素标记的ICP-MS检测方法更适用于精准定量，都具有重要的研究价值和意义。