春兰组培苗镁原卟啉IX甲基转移酶基因克隆及功能分析

蒋彧, 涂勋良, 何俊蓉

四川省农业科学院园艺研究所，四川 成都 610000

春兰（Cymbidium goeringii）是兰科（Orchidaceae）兰属（Cymbidium）中的一个种，具有较高的观赏价值和经济价值。‘宋梅’是中国春兰传统铭品，为梅瓣花的代表品种，被誉为春兰“四大天王”之首，“春兰之王”等，幽香馥郁，浓而不浊，深受广大兰友的喜爱。

镁原卟啉Ⅸ甲基转移酶（Magnesium protoporphyrin Ⅸ methyltransferase，ChlM）是叶绿素合成过程中的关键酶，也是重要的调控酶，其活性受到光照、叶绿体氧化还原状态和叶片中叶酸含量调控。此外，镁原卟啉Ⅸ甲基转移酶不仅影响PSⅠ、PSⅡ和Cytb6f 蛋白复合体内重要蛋白的积累，参与叶绿体到细胞核的反向信号转导、ABA 信号转导，还通过调控ChlH 表达影响镁螯合酶活性[1]。原卟啉Ⅸ甲基转移酶是单基因产物，定位在叶绿体被膜和类囊体膜上，其发挥作用时依赖于腺苷甲硫氨酸（ Ado-Met） ，属于S-腺苷-L-甲硫氨酸依赖的甲基转移酶大家族[2-3]。拟南芥At4g25080是编码该甲基转移酶的基因，在烟草[4]、水稻[5]、豌豆[6]、衣藻[7]中均发现ChlM 序列同源物。本研究从‘宋梅’组培苗叶片中克隆了春兰ClChlM1基因，构建pART-ClChlM1植物表达载体，进而在烟草中瞬时表达鉴定了该基因的叶绿素生物合成功能，旨在为春兰叶绿素合成途径的揭示及春兰叶色变异提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为春兰‘宋梅’组培苗，保存在四川省农业科学院园艺研究所组培室（见图1）。

图1 春兰‘宋梅’组培苗Fig.1 Tissue culture seedling of Cymbidium goeringii. ‘Songmei’

1.2 方法

根据天根生化科技有限公司的植物总RNA提取试剂盒说明书，从叶片样品中提取总RNA，利用Nanodrop2000（Thermo Scientific，美国）对RNA的浓度和纯度进行检测，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测RNA 完整性。

使用Aidlab公司反转录试剂盒（TUREscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit）进行cDNA的合成，反应体系为40 μL：500 ng总RNA，8 μL 5×RT Reaction Mix，2 μL Oligo（dT）引物，2 μL TUREscript HRTase/RI Mix，采用RNase Free dH2O补足至40 μL。反转录反应程序条件为：42 ℃ 60 min，65 ℃ 10 min。反应结束后，将得到的cDNA放置-20℃保存，用前稀释10倍使用。

1.2.2 ‘宋梅’ClChlM1基因克隆

根据表1的引物，从‘宋梅’cDNA中克隆了ClChlM1基因。PCR扩增程序：96 ℃ 10 min；96℃30 s；60 ℃ 30 secs，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃10 min。将扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶分离后对目的片段进行切胶回收，连入pMT18-T载体并转化大肠杆菌DH10B过夜培养。次日挑选克隆经菌落PCR验证后送至上海美吉生物医药科技有限公司测序。

1.2.3 ‘宋梅’ClChlM1进化树分析

选取铁皮石斛的DcChlM1、马蹄蝴蝶兰的PeChlM1、油棕的EgChlM1、深圳拟兰的AsChlM1、风铃木的HiChlM1、香蕉的MaChlM1、玉米的ZmChlM1、柑橘的CsChlM1、黄麻的CoChlM1，以及春兰的ClChlM1，采用MEGA 5.0构建系统进化树。

1.2.4 ‘宋梅’ClChlM1亚细胞定位

设计酶切引物对ClChlM1基因进行扩增，将扩增后的片段经XhoI和SalI双酶切后连入pBI121-GFP载体，并对拟南芥原生质体进行转化。通过荧光显微镜（Olympus BX51）观察融合蛋白的定位。

根据银隆相关人员的描述，魏银仓在未经债权人华融国际同意的情况下，通过魏旗下另一家公司受让银隆对华融国际3.75亿元债务，但并未实际还款，导致银隆的欠款依然存在。同时，在魏银仓任董事长期间，他与银隆签订《债权债务抵销协议》，导致其原本欠银隆的3.75亿元债务灭失。在这起事件中，其他股东并不知晓魏银仓所为。卢春泉坦承：“华融国际已申请对银隆的部分资金进行冻结。”

表1 引物序列Tab.1 Primers used in the present study

1.2.5 烟草转化

为了获得ClChlM1过量表达载体，将ClChlM1编码区序列插入pART-CAM，获得pART-ClChlM1载体[8]。通过农杆菌介导法将载体导入到本氏烟草中[9]。表1引物检测烟草的阳性转化率。

1.2.6 ALA和叶绿素的检测

按照Alawady and Grimm的方法检测ALA[4]。取烟草叶片，在含有40 mM乙酰丙酸（pH 6.9）的20 mM磷酸盐缓冲液（pH值7.5）中，置于光下培养4小时。取上清液，加入乙酰乙酸煮沸10分钟。加入等量的Ehrlich’s试剂，在553 nm下检测ALA。

检测烟草的叶绿素含量，用95%的乙醇和稀释的丙酮碾磨叶片。用紫外分光光度计检测665 nm,649 nm 和 470 nm波长[10]。

1.2.7 实时定量荧光PCR

引物序列详见表1。ACTIN基因作为内参，通过2-△△Ct法对目的基因表达量进行计算。

2 结果与分析

2.1 ClChlM基因克隆

通过RT-PCR获得了ClChlM1的开放阅读框（ORF）。DNA测序结果显示，ClChlM1的ORF长度为945 bp，编码314个氨基酸残基组成的蛋白质（见图2）。将ClChlM1序列提交至NCBI，序列号为MG574594。

2.2 ClChlM蛋白结构及进化树分析

选取春兰的ClChlM1、铁皮石斛的DcChlM1、深圳拟兰的AsChlM1、油棕的EgChlM1进行氨基酸序列比对，结果表明春兰的ClChlM与其余四种有较高的同源性，且都含有守的Mg-por_mtran_C区域（见图3 A）。

为进一步分析ClChlM进化关系，选取铁皮石斛的DcChlM1、马蹄蝴蝶兰的PeChlM1、油棕的EgChlM1、深圳拟兰的AsChlM1、风铃木的HiChlM1、香 蕉 的MaChlM1、玉 米 的ZmChlM1、柑 橘 的CsChlM1、黄麻的CoChlM1蛋白序列进行进化树构建，结果显示植物ChlM蛋白分为三个亚类，其中ClChlM与DcChlM1、PeChlM1、AsChlM1、EgChlM1、MaChlM1属于第I亚类，且与DcChlM1亲缘关系最近（见图3 B）。

2.3 ClChlM1亚细胞定位

原生质体转化结果显示ClChlM1-GFP融合蛋白绿色荧光与叶绿体探针红色荧光融合为黄色荧光，表明ClChlM1定位于叶绿体（见图4）。

2.4 ClChlM1基因功能验证

为进一步验证ClChlM1基因的功能，采用叶盘法将其转化到烟草中（见图5）。经PCR检测，获得三个转基因株系（见图5E）。

叶绿素是一种含卟啉化合物，ALA是卟啉生物合成过程中的一个重要前体。测定结果显示转基因株系中ALA合成效率显著高于对照株系，约为对照株系中的2.28倍（见图6）。

图2 ‘宋梅’ClChlM1核苷酸及推导氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequences of ClChlM1 from Cymbidium goeringii. ‘Songmei’

叶绿素含量测定结果显示转基因株系中叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总量含量远高于对照株系，分别是对照株系的1.32倍、1.56倍、1.35倍（见图7）。

图3 ClChlM1同源性比较及系统进化树分析Fig.3 Phylogenetic and alignment of ClChlM1 with homologous proteins from other plants

图4 ClChlM1亚细胞定位。Fig.4 Subcellular location of ClChlM1 in Arabidopsis protoplast

进一步对光合作用相关成员谷氨酰tRNA还原酶（HemA）, 谷氨酸酯-1-半醛2,1-氨基变位酶 （Gsa）,叶绿素a/b结合蛋白（LHCB）, 镁离子螯合酶CHLI和镁离子螯合酶CHLH在转基因烟草中的表达模式进行分析，结果显示除了ClHemA外，ClGsa、ClLHCB、ClCHLI、ClCHLH在转基因株系中的表达量均显著高于对照组（见图8）。

图5 ClChlM1烟草转基因Fig.5 Tobacco ClChlM1 transgenic

图6 转基因株系中ALA合成效率Fig.6 Efficiency of ALA Synthesis in Transgenic Strains

3 讨论

从春兰组培苗中克隆的ClChlM1基因ORF长度为945 bp，氨基酸序列分析显示ClChlM1拥有植物ChlM蛋白高度保守的Mg-por_mtran_C结构域，进化树分析显示ClChlM1与同为兰科植物的铁皮石斛的DcChlM1亲缘关系最近。

图7 转基因株系中叶绿素含量Fig.7 Chlorophyll content in transgenic lines

高等植物叶绿素生物合成属于典型的卟啉代谢途径，由谷氨肽-tRNA到叶绿素a和叶绿素b的形成共需经历十余步酶促反应，其中催化镁原卟啉Ⅸ（MgP）形成镁原卟啉Ⅸ单甲醚（MgPME）的ChlM是该过程关键酶之一[12]。最近还有研究表明ChlM可以在转录后水平对光合作用编码蛋白进行调控。LHCB是捕光天线蛋白，位于叶绿体类囊体膜上，作用是将吸收的光能传递到作用中心，启动光合作用。在大麦中，Gadjieva等发现ChlM产物MgPME的积累会促进LHCB基因的表达[13-14]。在本研究中，除了ClLHCB外，还发现ClGsa, ClCHLI和ClCHLH在ClChlM1过表达植株中显著上调，而ClHemA基因的表达量则无变化。HemA编码谷氨肽-tRNA还原酶，是叶绿素生物合成途径第一个酶；Gsa编码的谷氨酸-1-半醛转氨酶是叶绿素生物合成途径第二个酶，主要负责ALA的合成；CHLI和CHLH编码的蛋白是镁螯合酶的不同亚基，主要负责镁原卟啉IX的合成。因此，推测ClChlM1可反馈调节叶绿素的生物合成，具体的调控机制将是下一步研究重点。

图8 相关基因RT-PCR分析Fig.8 RT-PCR analysis of related genes