基于分子标记的入侵陕西草地贪夜蛾种群生物型分析

翟颖妍，袁冬贞，赵世磊，白应文，陈志杰，钱 丰，朱陵侠，洪 波*

(1.陕西省生物农业研究所，西安 710043；2.陕西省植物保护工作总站，西安 710003；3.商洛市植保植检站，陕西商洛 726000；4.宝鸡市农业技术推广服务中心，陕西宝鸡 721001；5.咸阳市植物检疫站，陕西咸阳 712000；6.安康市农业技术推广中心，陕西安康 725000)

草地贪夜蛾SpodopterafrugiperdaJ.E.Smith又称秋黏虫，为鳞翅目Lepidoptera夜蛾科Noctuidae灰翅夜蛾属Spodoptera害虫(冼继东等,2019)。该虫广泛分布在美洲热带及亚热带地区，具有很强的繁殖力及迁飞能力(Sparksetal.,1979)。草地贪夜蛾是世界范围的重大农业害虫，幼虫喜食玉米ZeamaysL.，据统计在美国佛罗里达州造成玉米减产20%(Earlyetal.,2018)，严重威胁粮食安全。草地贪夜蛾于2016年1月入侵非洲，2年内扩散至非洲44个国家，年潜在经济损失超过24亿美元，2018年7月首次在亚洲也门出现，2019年1月迁飞至我国云南省境内(Sunetal.,2019;王磊等,2019a)，截止2020年10月，草地贪夜蛾最北已发现扩散至辽宁省(张丹等,2021)。陕西省内最早在2019年5月于汉中市洋县发现草地贪夜蛾幼虫(余正军等,2020)。草地贪夜蛾入侵速度之快及取食范围之广，给我国粮食及生态安全带来了严重威胁，给草地贪夜蛾的综合防治带来了更大的挑战。

准确识别并快速鉴定入侵生物是研究防控策略首要的一步。根据寄主不同，草地贪夜蛾有玉米型(corn-strain)和水稻型(rice-strain)两种生物型(Nagoshietal.,2004)，在取食、交配及抗药性等方面存在较大差异，这两种生物型样本靠形态学方法无法区分，目前多使用分子生物学的手段进行鉴定。线粒体细胞色素C氧化酶亚基I基因(Cytochrome coxidase subunit I，COI)和位于Z染色体的磷酸甘油醛异构酶基因(Triose-phosphate isomerase,Tpi)是当前使用最广泛的分子标记基因(赵金凤等,2020)。COI基因位于线粒体，受母系遗传的影响，而Tpi基因位于细胞核，更具稳定性(Nagoshietal.,2016)，因此多将COI和Tpi两种分子标记结合起来进行鉴定并相互验证，有利于提高鉴定的准确性。

本研究采集了陕西省8个地市共计180个草地贪夜蛾样本，通过扩增COI及Tpi两个基因片段，在分子水平对入侵陕西的草地贪夜蛾进行鉴定并分析其种群生物型分子特征，以期为研究陕西省草地贪夜蛾的发生和扩散规律,以及草地贪夜蛾的监测及综合防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫的采集

本研究的草地贪夜蛾样本由陕西省8个地市的农技中心或植保站提供，采集时间为2020年和2021年7-9月(表1)。幼虫在田间采集后浸泡于无水乙醇，成虫使用性诱剂捕获后干燥处理，样本带回实验室后储存在-80℃低温冰箱备用。

表1 供试样本采集信息Table 1 Information of samples collection

1.2 DNA提取、PCR扩增及测序

切取草地贪夜蛾单头幼虫或成虫的头部置于1.5 mL离心管内，用TGrinder电动组织研磨器(OSE-Y30，天根)在液氮中研磨充分，使用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304-02，天根)，按照说明书进行DNA提取，得到的DNA作为PCR扩增模板。

分别使用COI及Tpi引物(Nagoshietal.,2017b;陈冬平等,2020)对草地贪夜蛾DNA进行PCR扩增(表2)。20 μL PCR反应体系：DNA模板1 μL，正反向引物各1 μL，Mix 10 μL，加ddH2O至20 μL。PCR反应为：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，60℃(COI)/52℃(Tpi)退火30 s，72℃延伸30 s，40个循环，72℃终延伸10 min，4℃保存。扩增后的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，将扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

表2 PCR扩增的引物信息Table 2 Primers used for PCR amplification

1.3 数据分析

使用DNAstar软件查看每个样本测序序列的峰图并进行正反向序列的拼接和校正，获得准确的基因片段序列。从NCBI数据库中下载相关草地贪夜蛾COI及Tpi基因序列，与本研究得到的序列在MEGA 6.0中进行ClustalW多重序列比对及差异位点分析(Tamuraetal.,2013)，确定本研究中草地贪夜蛾样本的生物型。选取代表性样本序列，使用MEGA 6.0采用邻接法(Neighbor-Joining,NJ)构建系统发育树(张丽娜等,2013)，设bootstrap值为1 000进行计算，构建完成的系统发育树在FigTree 1.4中进行编辑。

2 结果与分析

2.1 草地贪夜蛾 COI及 Tpi基因的扩增

对采集的草地贪夜蛾样本经过DNA提取和PCR扩增及测序，获得了180个COI基因片段及179个Tpi基因片段(商洛SL-28的PCR产物没有被扩增出来)，COI基因片段长度约为450 bp，Tpi基因片段长度约为400 bp(图1)。

图1 部分PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图Fig.1 Gel electrophoresis of partial PCR products注：A，COI基因；B，Tpi基因；M，DL2000 DNA Marker。Note:A,COI gene;B,Tpi gene;M,DL2000 DNA Marker.

2.2 COI单倍型分析

在草地贪夜蛾COI基因的第225和348位点处，水稻型对应的碱基为TA，玉米型有4种单倍型h1，h2，h3和h4，对应的碱基分别为：AA，AG，GA和GG(Nagoshietal.,2017a)(图2)。基于COI分子标记的分析结果表明，180个样本中COI基因在这两处位点的碱基序列有2种：TA和GG，即分别为水稻型和h4玉米型，其中水稻型(如样本SL-1)有152个，占比为84.44%，水稻型远多于玉米型，样本分布涵盖所有8个地市；h4玉米型(如样本XY-1)有28个样本，占比为15.56%，样本分布仅6个地市。其中每个地市玉米型占当地样本量的比例不同(表3)，渭南及商洛未发现玉米型。

表3 基于 COI基因的玉米型占当地总样本量的百分比Fig.3 Corn strain as percentage of the total sample based on COI gene markers

图2 COI基因玉米型和水稻型的单倍型比较Fig.2 Comparison of haplotypes of COI gene fragments between corn-strain and rice-strain

由于本研究样本中归为同种单倍型的序列高度一致，因此仅使用SL-1和XY-1样本为代表，与NCBI数据库中比对结果高度相似的序列一同构建系统发育树。SL-1和水稻型聚为一类，与印度MZ377096、我国云南MN068212及澳大利亚MW454868种群接近，XY-1和玉米单倍型聚为一类，与美国佛罗里达州CS-h4玉米型JN573290及印度MN615267种群一致(图3)。

图3 邻接法构建的基于COI基因分子标记的系统发育树(1 000次重复)Fig.3 NJ Phylogenetic tree based on COI gene fragments (1 000 replicates)注：JN573287、JN573288、JN573289、JN573290均采集自美国佛罗里达州(Nagoshi et al.,2007)，分别表示玉米型的4种单倍型，即CS-h1、CS-h2、CS-h3和CS-h4。Note:JN573287,JN573288,JN573289,and JN573290 were all identified from Florida,US (Nagoshi et al.,2007),and represented 4 haplotypes of corn-strain:CS-h1,CS-h2,CS-h3,and CS-h4,respectively.

2.3 Tpi 单倍型分析

草地贪夜蛾Tpi基因的位点136/137处，水稻型对应的碱基为TC，玉米型对应的碱基为CT；在位点125/126处，水稻型和玉米型对应的碱基分别为GA和AT(Nagoshi,2010)(图4)。另还有一种特殊的单倍型，有多个多态性位点(图4)，是一种非洲特异型ASH(Africa-specific haplotype)(Zhangetal.,2020)。

图4 基于Tpi基因的不同单倍型差异位点比较Fig.4 Comparison of different haplotypes of Tpi gene fragments注：黑色粗箭头表示区分水稻型和玉米型的位点(136/137位点是区分水稻型和玉米型的主要位点)，黑色细箭头表示区分样本中其他单倍型的位点；红色箭头表示非洲特异型的差异位点。Note:The bold black arrows indicated the loci used to identify R-strain and C-strain of fall armyworm (P136/137 were considered to be an effective diagnostic marker).The thin black arrows indicated the loci to distinguish other haplotypes.The red arrows indicated the loci specific to Africa-specific haplotype.

本研究共扩增出179个Tpi基因序列，在位点136/137处，179个样本的碱基均为CT排列；在位点125/126处，排列为AT的有164个样本(如样本XY-1)，排列为GA的有13个样本(如样本BJ-2)，排列为AT/GA杂合型的有2个样本，为YL-2和BJ-8。而商洛样本SL-3的多态性位点碱基排列与ASH一致，因此SL-3为非洲特异单倍型。

根据序列比对结果，发现179个样本中有6种单倍型(图4)，分别使用XY-1、BJ-2、SL-1、WN-3、BJ-8和SL-3这6个样本作为代表，与NCBI数据库中比对结果高度相似的序列一同构建系统发育树。XY-1、SL-1、BJ-2、BJ-8和WN-3均与美国佛罗里达州玉米型KT336237聚为同一大类，这5个样本均为玉米型。而SL-3与非洲特异单倍型MT767445聚为一类，同源性达100%，该样本序列来自广东湛江，且被鉴定为与非洲赞比亚卢萨卡样本序列一致，因此确定基于Tpi的SL-3样本为非洲特异单倍型，该非洲特异单倍型仅国内第2次出现。其他178个样本基于Tpi分子标记均鉴定为玉米型，没有样本与美国佛罗里达州水稻型KT336235聚为同一大类(图5)。

图5 邻接法构建的基于Tpi基因分子标记的系统发育树(1 000次重复)Fig.5 NJ Phylogenetic tree based on Tpi gene fragments (1 000 replicates)

3 结论与讨论

本研究对入侵陕西省关中、陕南和陕北8个地市的180个草地贪夜蛾样本进行了生物型分析。基于COI分子标记的结果表明，180个样本中水稻型占比为84.44%，h4玉米型占比为15.56%，8个地市均有水稻型，而安康、汉中、咸阳、西安、宝鸡、榆林6市出现了玉米型，虽然玉米型在样本中占比少但分布很广泛；而样本中水稻型多于玉米型的结果表明在我国水稻型的雌成虫在生存及交配中占据优势地位。基于Tpi的分子标记结果表明，陕西省内的179个样本除商洛SL-3为非洲特异单倍型外，其余均为玉米型，无水稻型。因此基于COI分子标记的鉴定结果为约84%的样本为水稻型，而基于Tpi分子标记的鉴定结果为几乎所有的样本为玉米型，这两种分子标记的鉴定结果不一致的情况也出现在其他研究中(唐运林等,2019;徐丽娜等,2019;张磊等,2019;王佳丽等,2020;赵金凤等,2020)。由于水稻型和玉米型的草地贪夜蛾之间不存在生殖隔离(Dumasetal.,2015)，在自然界中存在两种生物型的杂交种，另外COI分子标记有细胞质遗传特点，母本基因遗传给下一代，而Tpi分子标记位于细胞核的性染色体Z中，草地贪夜蛾属于ZW型性别决定(雌性ZW，雄性ZZ)，当水稻型母本和玉米型父本杂交，后代获得了水稻型线粒体的COI基因，Tpi基因则经过长期的繁衍演化更多保留了玉米型基因，即后代携带水稻型线粒体基因和玉米型核基因形成了特殊的杂合玉米型草地贪夜蛾。因此，综合COI和Tpi分子标记的鉴定结果，表明入侵陕西省的草地贪夜蛾约84%为水稻型母本与玉米型父本杂交形成的杂合玉米型草地贪夜蛾，而纯玉米型草地贪夜蛾约占15%。基于COI和Tpi分子标记的鉴定方法可以快速区分出草地贪夜蛾样本及其生物型，不过这种区分是不全面的，通常需要与微卫星标记法相结合(Pavinatoetal.,2013)，以便更全面地挖掘草地贪夜蛾的种群多样性和遗传结构规律。

据报道草地贪夜蛾能够寄生的植物超过350种(Déboraetal.,2018)，目前在我国发现主要危害玉米、高粱Sorghumbicolor(L.) Moench和甘蔗SaccharumofficinarumL.(郭井菲等,2019)。草地贪夜蛾的迁飞性极强，再加上我国广泛分布的并非单一的生物型，而是杂合型草地贪夜蛾，理论上具有杂交优势，是否对其他作物产生潜在危险应当引起重视。

值得注意的是，商洛地区还出现了非洲特异型样本，除了在2019年8月广东镇江发现过外，在其他省市地区暂未见报道，该发现为草地贪夜蛾在我国东西线迁飞与扩散规律研究提供了新的参考依据(王磊等,2019b;陈辉等,2020)。基于Tpi基因位点296处碱基与水稻型相同的结果(图4)，这种非洲特异型最初被识别为水稻型(Nagoshietal.,2012)，而也有分析草地贪夜蛾的基因组SNPs发现，相较于水稻型SNP，该单倍型包含更多的玉米型SNP(Zhangetal.,2020)，因此该单倍型应归于哪种生物型目前仍有争议，同时该非洲特异型草地贪夜蛾在取食行为及抗药性方面是否与水稻型和玉米型存在明显差异还有待进一步探究。

截至2021年9月，在陕西省关中地区和陕北榆林地区均发现草地贪夜蛾为害，而位于两者之间的铜川和延安2个地市目前仍未发现草地贪夜蛾入侵，其在陕西省的种群扩散趋势仍不明朗，需要进一步对入侵陕西省的草地贪夜蛾地理种群遗传结构特征进行分析，为草地贪夜蛾的监测及防控提供理论支撑。